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原文传递用于测定维生素D的方法和成分

专利名称：	用于测定维生素D的方法和成分
摘要：	本发明提供用于测定样品中维生素D部分的方法和成分，例如试剂盒，包括或使用，特别包括，能够使维生素D部分与其结合蛋白分离的缓冲液和/或酸性pH缓冲液，和至少两种抗体，例如至少两种单克隆抗体，其分别偶联在颗粒上，例如乳胶颗粒上，其中至少一种所述抗体(或第一抗体)对维生素D部分具有特异的结合亲和力，而至少另一种所述抗体(或第二抗体)对第一抗体和维生素D部分之间形成的复合物具有特异的结合亲和力，如果存在于所述样品中。在一些实施例中，测量所述抗体与维生素D部分之间的凝集反应引起的光学变化以确定样品中维生素D的含量。还提供用于测定样品中维生素D部分的试剂盒和反应混合物。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	美国;US
申请人：	DIAZYME研究室有限公司
发明人：	袁崇生;法赫里·本·赛达
专利状态：	有效
申请日期：	2017-07-28T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-07T00:00:00+0800
申请号：	CN201780046834.8
公开号：	CN109863406A
代理机构：	北京海虹嘉诚知识产权代理有限公司
代理人：	吴泳历
分类号：	G01N33/82(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	美国加利福尼亚州圣地亚哥
主权项：	1.用于测定样品中维生素D部分的方法，所述方法包括： a)使含有或疑似含有维生素D部分的样品接触能够使维生素D部分与其结合蛋白分离的缓冲液和/或酸性pH缓冲液，以及至少两种抗体，例如至少两种单克隆抗体，其连接到，例如分别偶联到，表面或颗粒，例如纳米颗粒，其中所述抗体中至少一种抗体(或第一抗体)对维生素D部分具有特异的结合亲和力，而至少另一种所述抗体(或第二抗体)对第一抗体和维生素D部分之间形成的复合物具有特异的结合亲和力，并且任选地，所述抗体不同于所述维生素D部分的天然维生素D结合蛋白；和 b)评估所述抗体，例如所述特异性抗体，和所述维生素D部分之间的结合以确定所述样品中所述维生素D部分的存在、缺失和/或数量。 2.权利要求1所述的方法，在评估所述抗体和所述维生素D部分之间的结合之前不包括从样品中去除天然维生素D结合蛋白的步骤，和/或不包括洗涤步骤。 3.权利要求1或2所述的方法，其被实施为均相测定。 4.权利要求1-3任一所述的方法，其中使所述样品与单一反应混合物接触，所述单一反应混合物包含能够使所述维生素D部分与其结合蛋白分离的酸性pH缓冲液，以及分别结合在颗粒上，例如乳胶颗粒上的配对抗体，其中一种抗体或第一抗体对所述维生素D部分具有特异的结合亲和力，而另一种抗体或第二抗体对第一抗体和维生素D部分之间形成的复合物具有特异的结合亲和力。 5.权利要求1-4任一所述的方法，其中包含样品、酸性pH缓冲液以及结合在颗粒上，例如纳米颗粒上的抗体的最终反应混合物的pH为约3.0至约13，优选约5.5至约8.5。 6.权利要求1-5任一所述的方法，其被用于评估个体中维生素D部分的状态，并且所述样品是从所述个体获得和/或衍生的生物样品。 7.权利要求1-6任一所述的方法，其中所述维生素D部分是25(OH)D2，25(OH)D3或25(OH)D2和25(OH)D3的总和。 8.权利要求1-7任一所述的方法，其中所述酸性pH缓冲液是乙酸钠缓冲液，或柠檬酸钠缓冲液，或磷酸缓冲液，或其组合，或在酸性pH范围内具有缓冲功能的任何缓冲液。 9.权利要求8所述的方法，其中所述酸性缓冲液的pH为约2.5至约6.9。 10.权利要求1-9任一所述的方法，其中所述抗体为配对的单克隆抗体，其中一种抗体或第一抗体对维生素D部分具有特异的结合亲和力，而另一种抗体或第二抗体对第一抗体和维生素D部分之间形成的复合物具有特异的结合亲和力。 11.权利要求1-10任一所述的方法，其中所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体和多克隆抗体的组合。 12.权利要求10所述的方法，其中第一抗体特异地结合25(OH)D，而第二抗体特异地结合第一抗体与25(OH)D之间形成的复合物。 13.权利要求10所述的方法，其中第一抗体和第二抗体分别偶联在颗粒上，例如纳米颗粒上，并在测定过程中作为单组合试剂使用或作为两种分开的试剂使用。 14.权利要求1-13任一所述的方法，其中所述酸性pH缓冲液包含盐、共聚物，和/或在短时间内(例如，少于30min)促使维生素D部分与其结合蛋白部分或全部分离的洗涤剂。 15.权利要求14所述的方法，其中所述盐、共聚物，和/或洗涤剂包含于所述酸性pH缓冲液中，或包含于分开的用于在所述测定过程中与所述酸性pH缓冲液混合的试剂溶液中。 16.权利要求1-15任一所述的方法，其中所述颗粒，例如纳米颗粒，包含聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基萘、聚(二乙烯基苯)、聚乙烯萘、苯乙烯的共聚物、丙烯酸二乙烯苯、萘、碳60、磁珠、金、银、硅、二氧化硅、二氧化铬，和/或二氧化钛。 17.权利要求1-16任一所述的方法，使用颗粒增强的免疫比浊法、颗粒增强的免疫散射比浊法或基于磁性颗粒(珠)的免疫测定法实施所述方法。 18.权利要求17所述的方法，其中使用了乳胶颗粒，并且所述颗粒的大小(直径)为约30nm至约500nm。 19.权利要求17所述的方法，当使用磁性颗粒时，所述颗粒的大小(直径)可以是约500nm至约2,000nm，任选地，所述第一抗体包被在所述磁性颗粒上并且所述第二抗体标记有化学发光或荧光信号生成分子，例如吖啶酯、异鲁米诺、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶，或荧光素或绿色蛋白，此外任选地，以非均相形式实施所述测定，包括一个或两个洗涤步骤。 20.权利要求19所述的方法，其中所述测定为包含相分离步骤的非均相测定。 21.权利要求1-20任一所述的方法，其中所述测定在30min或更短的时间内完成。 22.权利要求1-21任一所述的方法，其中使用通用化学分析仪或临床化学分析仪进行所述测定。 23.权利要求1-22任一所述的方法，其中所述测定以均相形式进行，在测定之前或测定过程中无需从样品中物理去除任何基质，例如维生素D结合蛋白。 24.权利要求19所述的方法，其中所述测定在60min或更短的时间内完成。 25.用于测定样品中维生素D部分的试剂盒，所述试剂盒包括： a)能够使维生素D部分与其结合蛋白分离的缓冲液和/或酸性pH缓冲液； b)至少两种抗体，例如至少两种单克隆抗体，其连接到，例如分别偶联到，表面或颗粒，例如，乳胶颗粒，其中所述抗体中至少一种抗体(或第一抗体)对维生素D部分具有特异的结合亲和力，而至少另一种所述抗体(或第二抗体)对第一抗体和维生素D部分之间形成的复合物具有特异的结合亲和力，如果存在于所述样品中，并且任选地，所述抗体不同于所述维生素D部分的天然维生素D结合蛋白。 26.权利要求25所述的试剂盒，还包括用于评估所述至少两种抗体和所述维生素D部分之间的结合以确定所述样品中所述维生素D部分的存在、缺失和/或数量的工具。 27.权利要求25所述的试剂盒，包括： 1)包含酸性pH缓冲液的第一检测试剂，所述酸性pH缓冲液包含盐、聚合物和/或洗涤剂，和 2)包含配对抗体的第二检测试剂，所述抗体分别偶联在颗粒上，例如纳米颗粒上，其中一种抗体或第一抗体对25(OH)D具有特异的结合亲和力，而另一种抗体或第二抗体对第一抗体和25(OH)D之间形成的复合物具有特异的结合亲和力。 28.使用权利要求25-27任一所述的试剂盒测定样品中维生素D部分的方法，所述方法包括： a)形成样品和第一检测试剂的混合物并孵育所述混合物一段时间，然后向所述混合物中加入第二检测试剂；和 b)通过测量反应混合物的光学变化并使用一组25(OH)D校准品来定量样品中的25(OH)D。 29.使用权利要求25-27任一所述的试剂盒测定样品中维生素D部分的方法，所述方法包括： a)在第一检测试剂存在的情况下使样品接触包被在微量滴定板上的第一抗体，并孵育所述混合物一段时间；和 b)加入标记有信号分子(例如HRP)的第二抗体，和 c)孵育和洗涤步骤之后，基于信号强度和校准曲线确定所述样品中维生素D部分的存在、缺失和/或数量。 30.用于测定样品中维生素D部分的试剂盒，所述试剂盒包括： a)酸性pH缓冲液； b)包被有第一抗体的颗粒，例如磁性颗粒，所述第一抗体对所述维生素D部分具有特异的结合亲和力； c)标记有信号生成分子的第二抗体，所述信号生成分子选自吖啶酯、异鲁米诺、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或荧光素； d)化学发光或荧光信号生成所需的底物溶液和/或引发剂。 31.权利要求30所述的试剂盒，还包括底物溶液和/或引发剂。 32.权利要求30或31所述的试剂盒，其被配置为在信号检测之前包含相分离步骤和/或洗涤步骤的非均相测定。 33.用于测定样品中维生素D部分的制品，所述制品包括权利要求30-32任一所述的试剂盒，以及化学发光或荧光信号生成所需的底物溶液和/或引发剂。 34.权利要求1-24任一所述的方法或权利要求25-27和30-32任一所述的试剂盒，其中所述另一种抗体(第二抗体)特异地结合所述维生素D部分的表位，所述表位未被所述一种抗体(或第一抗体)结合。 35.权利要求1-24任一所述的方法或权利要求25-27和30-32任一所述的试剂盒，其中所述另一种抗体(第二抗体)结合或特异地结合所述一种抗体(或第一抗体)。 36.用于测定样品中维生素D部分的方法，所述方法包括： a)使所述样品接触第一试剂，所述第一试剂包含酸性pH缓冲液以使所述样品中的维生素D部分与其结合蛋白分离； b)使步骤a)得到的所述样品中的维生素D部分接触第二试剂，所述第二试剂包含颗粒，例如磁性颗粒，所述颗粒包被有第一抗体，所述第一抗体对所述维生素D部分具有特异的结合亲和力以形成维生素D部分/第一抗体复合物；和 c)使所述维生素D部分/第一抗体复合物接触第三试剂，所述第三试剂包含标记有信号生成基团或分子的第二抗体，以形成所述维生素D部分、所述第一抗体和所述标记有信号生成基团或分子的第二抗体之间的复合物；和 d)评估来自所述维生素D部分、所述第一抗体复合物和所述第二抗体之间的复合物的信号，以确定所述样品中所述维生素D部分的存在、缺失和/或数量。 37.权利要求36所述的方法，其中所述信号生成基团或分子选自由吖啶酯、异鲁米诺、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和荧光素组成的组。 38.用于测定样品中维生素D部分的方法，所述方法包括： a)使含有或疑似含有维生素D部分的样品接触能够使维生素D部分与其结合蛋白分离的缓冲液和/或酸性pH缓冲液，以及至少两种抗体，例如至少两种单克隆抗体，所述抗体中至少一种抗体(或第一抗体)对维生素D部分具有特异的结合亲和力并连接到固体表面，例如微量滴定板或颗粒的固体表面，而至少另一种所述抗体(或第二抗体)对所述第一抗体和所述维生素D部分之间形成的复合物具有特异的结合亲和力并标记有信号生成基团；和 b)评估所述抗体，例如所述特异性抗体，和所述维生素D部分之间的结合以确定所述样品中所述维生素D部分的存在、缺失和/或数量。 39.权利要求38所述的方法，其中所述抗体不同于所述维生素D部分的天然维生素D结合蛋白。
所属类别：	发明专利