详情

原文传递一种基于混合生物样本的酰基肉碱大规模定性方法

专利名称：	一种基于混合生物样本的酰基肉碱大规模定性方法
摘要：	本发明公开了一种基于混合生物样本的酰基肉碱大规模定性方法。针对不同类型的生物样本(血，尿，组织)，采用乙腈/水作为提取剂，涡旋(血，尿)/珠打研磨(组织)作为提取方法，离心取上清液进行真空冷冻干燥后，用乙腈/水复溶并混合，采用超高效液相色谱‑组合型四极杆离子阱质谱联用仪进行分析。基于标样得到的特征子离子和中性丢失，筛选出母离子，进行平行反应监测模式检测。本发明方法检测样本得到的代谢物种类丰富，大大增加了一次分析可定性出的酰基肉碱数目。本发明方法具有前处理简单，定性可靠，酰基肉碱结构信息获取充分等优点。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	辽宁;21
申请人：	中国科学院大连化学物理研究所
发明人：	许国旺;于迪;周丽娜
专利状态：	有效
申请日期：	2017-12-01T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-11T00:00:00+0800
申请号：	CN201711246815.8
公开号：	CN109870535A
代理机构：	沈阳科苑专利商标代理有限公司
代理人：	马驰
分类号：	G01N30/88(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	116023 辽宁省大连市中山路457号
主权项：	1.一种基于混合生物样本的酰基肉碱大规模定性方法，其特征在于： (1)分别将血样、尿样采用乙腈作为提取剂，以涡旋方式提取；组织样采用乙腈/水作为提取剂，以珠打研磨方式提取；分别离心取上清液进行真空冷冻干燥，得冻干样本； (2)血、尿、组织冻干样本分别用乙腈/水复溶，混合； (3)采用超高效液相色谱-组合型四极杆离子阱质谱联用仪分层采集信息，即第一步数据依赖监测模式采集二级质谱信息，筛选对应的酰基肉碱母离子；第二步扩展酰基肉碱母离子种类后，用平行反应监测模式采集二级质谱信息，确认酰基肉碱结构； (4)根据二级质谱信息，实际色谱保留时间和预测油水分配系数ClogP的对应关系，对生物样本中的酰基肉碱进行检测和结构鉴定； (5)预测样品中未检测到的酰基肉碱的保留时间，进一步扩展酰基肉碱种类。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中吸取50-100μL正常人的混合血样/尿样置于1.5mL离心管中；加入200-400μL乙腈，涡旋30-60s；称取小鼠的肝组织5-10mg±0.5mg置于2mL离心管中，依次加入氧化锆小球，500-1000μL体积比为5:1-3:1的乙腈/水，采用混合研磨仪在20-30Hz的条件下研磨提取1-2min，重复两次；将上述的血，尿，组织提取后的样品放入离心机中，在3-5℃，13000-15000rpm条件下离心10-15min；取离心之后的上清液，其中血样225-450μL，尿样230-460μL，组织210-430μL，置于1.5mL离心管中；放入真空冷冻干燥机中，在3-5℃下冻干3-4h，冻干样本封好备用。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中冻干后的样品分别加入50μL体积比为1:2-1:4的乙腈/水；其中含9种氘代内标，乙酰肉碱-d3，丁酰肉碱-d3，己酰肉碱-d3，辛酰肉碱-d3，癸酰肉碱-d3，十二酰基肉碱-d3，十六酰基肉碱-d3，3-羟基异戊酰肉碱-d3，3-羟基-9-十六碳烯酰基肉碱-d3，内标物的浓度均为0.05-0.15μg/ml；涡旋至完全溶解后，置于离心机，在3-5℃，13000-15000rpm条件下离心10-15min，取上清液，涡旋混合待分析。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)采用超高效液相色谱-组合型四极杆离子阱质谱联用仪进行数据依赖监测-平行反应监测递进式的信息采集方案；液相色谱-质谱操作条件如下： (1)液相色谱条件：Waters BEH C18色谱柱2.1mm×100mm,1.7μm；柱温为40℃；流动相：A相为0.1％甲酸的水，B相为乙腈；流量设置为0.35mL/min；总的色谱运行时间为26min；洗脱梯度为：0～0.5min，10％B，0.5～3min，10％-15％B，3～5min，15～30％B，5～21min，30～97％B，21～23min,97％,23～23.5min，97～10％B，23.5～26min，10％B；进样室温度为4℃；进样体积为5μL； (2)质谱条件：ESI源，正离子模式，喷雾电压3.5kV；鞘气、加热气、吹扫气分别为45、10、0；接口温度、加热气温度分别为300，350℃；碰撞能为15eV，30eV，45eV。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中根据数据依赖模式-非靶向扫描得到的二级质谱信息，设置质量精度为±10ppm以内，筛选出能产生3个特征子离子m/z60.0808、m/z 85.0284、m/z144.1019和一个中性丢失m/z 59.0735的母离子；通过文献调研和数据库检索，基于同系物之间相差一个或多个亚甲基，扩展母离子的数目，再对母离子进行平行反应监测模式的靶向分析。 6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中根据色谱保留行为，二级质谱信息对酰基肉碱进行鉴定，满足以下条件的代谢物定性为酰基肉碱：①母离子质量精度设置为±5ppm以内；②子离子质量精度设置为±10ppm以内，必须含有m/z 85.02841的特征子离子，且该子离子的色谱保留行为与母离子相同；③二级质谱中需包含子离子m/z 60.0808，m/z144.1019及中性丢失m/z 59.0735中的至少2个；定性为酰基肉碱的代谢物进一步根据二级质谱信息，推测酰基肉碱的酰基链官能团和可能的结构。 7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中采用 Chemdraw软件得到标样的预测油水分配系数ClogP值，根据色谱洗脱梯度，将实际保留时间与预测油水分配系数ClogP分为0～3min，3～5min，5～21min三个时间段进行拟合，得到拟合公式；将根据推测的酰基肉碱结构采用Chemdraw软件得到具有该结构的全部异构体的ClogP范围，将ClogP最大和最小值代入拟合公式即得到具有该结构酰基肉碱的预测保留时间范围：如实测保留时间如落在该范围内，则认为推测结构可靠，否则结构待定。 8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中基于已定性出的酰基肉碱，针对每一系列的同系物，将其碳数和保留时间拟合成线性函数；根据同系物保留规律，将未检测到的同系物碳数代入该拟合函数，预测样品中其保留时间，扩展酰基肉碱数目。
所属类别：	发明专利