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原文传递流式抗体及其制备方法和滴定方法

专利名称：	流式抗体及其制备方法和滴定方法
摘要：	本发明涉及一种流式抗体及其制备方法和滴定方法，该流式抗体的制备方法包括如下步骤：采用反应缓冲液制备APC溶液；向所述APC溶液中加入ASE，于37±1℃条件下进行封闭反应，得第一中间体；向含所述第一中间体的反应缓冲液中加入SMCC，于37±1℃条件下进行活化反应，得第二中间体；将DTT与IgG或IgM于37±1℃条件下进行还原反应，得还原IgG或还原IgM；将含还原IgG或还原IgM的反应缓冲液与含所述第二中间体的反应缓冲液混合，于4℃条件下，过夜反应，得第三中间体；向含所述第三中间体的反应缓冲液中加入NEM，于37±1℃条件下反应，即得。该流式抗体的制备方法操作简便，可重复使用，且制成的流式抗体染色指数显著提升，明显减少背景结合，显著提升目标细胞的荧光亮度。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司
发明人：	杨飞;冷毅斌;张念元;王长乐;邓小龙
专利状态：	有效
申请日期：	2019-02-18T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-14T00:00:00+0800
申请号：	CN201910119662.3
公开号：	CN109883932A
代理机构：	武汉蓝宝石专利代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	方菲
分类号：	G01N15/14(2006.01);G;G01;G01N;G01N15
申请人地址：	430000 湖北省武汉市中国(湖北)自贸区武汉片区高新二路388号武汉光谷国际生物医药企业加速器一期工程厂房1单元808室
主权项：	1.一种流式抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：采用反应缓冲液制备APC溶液；向所述APC溶液中加入ASE，于37±1℃条件下进行封闭反应，得第一中间体；向含所述第一中间体的反应缓冲液中加入SMCC，于37±1℃条件下进行活化反应，得第二中间体；将DTT与IgG或IgM于37±1℃条件下进行还原反应，得还原IgG或还原IgM；将含还原IgG或还原IgM的反应缓冲液与含所述第二中间体的反应缓冲液混合，于4℃条件下，过夜反应，得第三中间体；向含所述第三中间体的反应缓冲液中加入NEM，于37±1℃条件下反应，即得。 2.根据权利要求1所述的流式抗体的制备方法，其特征在于，所述IgG或IgM与所述APC的质量比例为19-21:22-25。 3.根据权利要求1或2所述的流式抗体的制备方法，其特征在于，还包括剔除未反应的ASE、剔除未反应的SMCC、剔除未反应的DTT、剔除未反应的NEM的步骤。 4.根据权利要求3所述的流式抗体的制备方法，其特征在于，剔除未反应的试剂的步骤为：将反应后的相应溶液稀释，转移至50kDa超滤管中，于11000-13000rpm转速下离心2-10min。 5.根据权利要求1或2所述的流式抗体的制备方法，其特征在于，所述反应缓冲液为磷酸盐缓冲液。 6.根据权利要求1或2所述的流式抗体的制备方法，其特征在于，所述采用反应缓冲液制备APC溶液包括如下步骤：取APC的饱和硫酸铵溶液，离心，弃上清液，采用反应缓冲液溶解沉淀的APC，再次离心，将液体体积浓缩至第一预设浓度。 7.由权利要求1至6任一项的所述流式抗体的制备方法制备而成的流式抗体。 8.权利要求7所述的流式抗体在流式细胞术中的应用。 9.一种流式抗体的滴定方法，其特征在于，采用流式细胞术对所述流式抗体进行滴定，包括如下步骤：取权利要求7所述的流式抗体置于EP管中，用反应缓冲液稀释至第二预设浓度；从第二预设浓度的流式抗体溶液中取出一半体积的流式抗体溶液移入新的EP管中，加入反应缓冲液，对流式抗体进行对半稀释；如此下去，依次对新的EP管中的流式抗体溶液进行对半稀释至第10管，得到呈浓度梯度的各流式抗体溶液，再向各管中加入小鼠脾脏细胞，于4℃条件下进行染色反应，再加入适量磷酸盐生理缓冲液，离心，弃上清液，重复一次；再用磷酸盐生理缓冲液垂悬沉淀的小鼠脾脏细胞，上机检测细胞APC通道荧光信号。 10.根据权利要求9所述的流式抗体的滴定方法，其特征在于，所述小鼠脾脏细胞的制备过程如下：获取小鼠脾脏，用磷酸盐生理缓冲液清洗干净后，置于200目筛网上，用注射器活塞研磨，得到小鼠脾脏细胞悬液；将所述小鼠脾脏细胞悬液离心，弃去上清，沉淀的细胞用红细胞裂解液重悬，室温静置后，加入磷酸盐生理缓冲液混匀；离心，弃上清液；加入磷酸盐生理缓冲液重悬细胞，弃上清液，向沉淀的细胞中加入磷酸盐生理缓冲液，对细胞计数后，调整细胞密度到2×107个/mL；细胞按照50μL/管分装，即每管含1×106个小鼠脾脏细胞。
所属类别：	发明专利