详情

原文传递一种肝癌的多重免疫组化分析试剂盒及其使用方法和应用

专利名称：	一种肝癌的多重免疫组化分析试剂盒及其使用方法和应用
摘要：	本发明提供一种肝癌的多重免疫组化分析试剂盒及其使用方法和应用，涉及多重免疫组化技术领域，本发明所述多重免疫组化分析试剂盒，其中限定了单克隆抗体组包括第一单克隆抗体组(panel 1)和第二单克隆抗体组(panel 2)；所述第一单克隆抗体组包括PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD8单克隆抗体、CD66B单克隆抗体和CD163单克隆抗体；所述第二单克隆抗体组包括PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD8单克隆抗体、PD1单克隆抗体和CD68单克隆抗体。本发明所述多重免疫组化分析试剂盒以人离体肝组织石蜡切片为样本进行检测，进而预测免疫检查点抑制剂对肝癌的作用有效性。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	臻悦生物科技江苏有限公司
发明人：	张恒辉;陈衍辉;罗红丽;王雅婷;胡莹;刘阳;石伟;陆吉麟
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-29T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-14T00:00:00+0800
申请号：	CN201910248228.5
公开号：	CN109884303A
代理机构：	北京高沃律师事务所
代理人：	赵晓琳
分类号：	G01N33/574(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	225300 江苏省泰州市中国医药城口泰路西侧、陆家路东侧G57幢73号二层东侧
主权项：	1.一种肝癌的多重免疫组化分析试剂盒，包括单克隆抗体组、抗原修复液、辣根过氧化物酶标记的二抗、过氧化氢、核染色剂和荧光基团标记的酪氨盐，所述荧光基团标记的酪氨盐中荧光基团的种类数量与单克隆抗体组中单克隆抗体种类的数量一致；所述单克隆抗体组包括第一单克隆抗体组和第二单克隆抗体组；所述第一单克隆抗体组包括PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD8单克隆抗体、CD66B单克隆抗体和CD163单克隆抗体；所述第二单克隆抗体组包括PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD8单克隆抗体、PD1单克隆抗体和CD68单克隆抗体。 2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括防猝灭剂、洗涤剂和封闭液。 3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为TBST缓冲液。 4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核染色剂为DAPI染色剂。 5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团包括520-FITC、570-Cy3、620-Cy3.5、650-Cy5和690-Cy5.5。 6.一种权利要求1～5任意一项所述肝癌的多重免疫组化分析试剂盒的使用方法，包括以下步骤： (1)将待测样品与所述单克隆抗体组中的任意一种单克隆抗体混合，孵育，洗涤，得到抗原-一抗复合物； (2)将抗原-一抗复合物与辣根过氧化物酶标记的二抗混合，孵育，洗涤，得到抗原-一抗-二抗复合物； (3)将抗原-一抗-二抗复合物、任意一种荧光基团标记的酪氨盐以及过氧化氢混合进行荧光染色，孵育，洗涤，得到第一荧光标记复合物； (4)将第一荧光标记复合物与抗原修复液混合，微波处理，洗涤，得到第二荧光标记复合物；所述微波处理的条件包括：750～850w处理1～3min，再以200～300w处理12～20min； (5)以第二荧光标记复合物作为待测样品重复步骤(1)～(4)，重复至所述单克隆抗体组中的各单克隆抗体全部与待测样品结合过一次为止，得到多重标记复合物；其中，步骤(1)中第一次和每次重复采用的单克隆抗体互不相同，步骤(3)中第一次和每次重复采用的荧光基团标记的酪氨盐互不相同； (6)向步骤(5)所得的多重标记复合物中添加核染色剂，孵育，洗涤，封片，以连续光谱成像、检测。 7.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，步骤(1)中，当孵育的单克隆抗体为CD66B单克隆抗体、PanCK单克隆抗体、CD163单克隆抗体、CD8单克隆抗体、PD1单克隆抗体或CD68单克隆抗体时，孵育温度为35～42℃；当孵育的单克隆抗体为PDL1单克隆抗体时，孵育温度为2～6℃；所述第一单克隆抗体组中抗体的孵育顺序依次为：CD66B单克隆抗体、PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD163单克隆抗体、CD8单克隆抗体；所述第二单克隆抗体组中抗体的孵育顺序依次为：PD-1单克隆抗体、PanCK单克隆抗体、PDL1单克隆抗体、CD8单克隆抗体、CD68单克隆抗体。 8.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，所述步骤(1)中单克隆抗体使用时稀释倍数为50～500倍；所述步骤(2)中，辣根过氧化物酶标记的二抗的用量为50～200μL/样品。 9.权利要求1～5任意一项所述肝癌的多重免疫组化分析试剂盒在预测免疫检查点抑制剂对肝癌治疗有效性中的应用，其特征在于，所述应用包括： S1、利用权利要求1～6任意一项所述试剂盒检测待测样品中CD8+PDL1-，CD8+PD1-，CD68+PD1-，CD68+PDL1-，CD68+和CD8+的数量； S2、根据S1的测定结果计算CD68+/CD8+的比值； S3、根据S1和S2的测定和计算结果，当待测样品中CD8+PDL1-＞2.14、CD8+PD1-＞2.83时，判断免疫检查点抑制剂对该待测样品来源的患者治疗有效性高；或者当待测样品中CD68+/CD8+＜5.49、CD68+PD1-＜8.15和CD68+PDL1-＜8.15时，判断免疫检查点抑制剂对该待测样品来源的患者治疗有效性高。
所属类别：	发明专利