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原文传递血清中IgG糖肽的绝对定量分析

专利名称：	血清中IgG糖肽的绝对定量分析
摘要：	本发明提供了一种血清中免疫球蛋白G(IgG)糖肽的绝对定量方法。工艺过程包括两部分：一方面进行IgG糖肽标准品的二维亲水色谱法纯化制备及其定量分析，另一方面采用标准添加的方法进行血清样品中IgG糖肽绝对定量分析。采用标准IgG进行糖肽标品的制备，包括糖肽的释放、反相色谱法富集IgG糖肽、二维亲水色谱法分离纯化及质谱表征；定量分析则是将糖肽标品进行PNGase F糖链释放，对去糖基化的IgG糖肽肽段采用内标曲线进行MRM定量分析，获得每种纯化IgG糖肽的摩尔浓度。血清中IgG糖肽含量测定通过标准添加的方法实现，即一份添加已知浓度的IgG糖肽标准品，另一份不添加进行MRM分析，根据二者峰面积差和添加标品糖肽浓度计算血清中IgG对应糖型糖肽的含量。在此基础上，可计算糖肽绝对相应因子。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	辽宁;21
申请人：	中国科学院大连化学物理研究所
发明人：	梁鑫淼;曹翠岩;于龙;付冬梅
专利状态：	有效
申请日期：	2017-12-08T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-18T00:00:00+0800
申请号：	CN201711293842.0
公开号：	CN109900815A
代理机构：	沈阳科苑专利商标代理有限公司
代理人：	马驰
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	116023 辽宁省大连市中山路457号
主权项：	1.血清中免疫球蛋白G糖肽绝对定量方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)IgG标准品酶解：用缓冲溶液将血清稀释，然后加入二硫苏糖醇进行二硫键还原，反应产物中加入碘代乙酸，得到反应液，将反应液中加入胰蛋白酶进行酶解反应； 2)免疫球蛋白G糖肽富集：酶解液进行反相色谱富集，经nano-ESI-Q-TOF分析，洗脱得到免疫球蛋白G各亚型糖肽组分IgG1、IgG2、IgG3/4； 3)免疫球蛋白G各亚型糖肽组分分别进行二维亲水色谱分离纯化：将步骤2)中收集的免疫球蛋白G各亚型糖肽组分分别进行二维亲水色谱分离纯化，收集二维纯化馏分为免疫球蛋白G中性糖肽单体馏分； 4)质谱表征：将步骤3)中收集的免疫球蛋白G中性糖肽单体馏分分别进行MALDI-TOF质谱定性分析，各亚型单体糖肽单体根据其糖型分别命名，；将步骤3)中收集的免疫球蛋白G酸性糖肽单体馏分分别进行ESI-Q-TOF质谱定性分析,S代表酸性糖(唾液酸)； 5)糖链释放：取已知体积步骤3)中收集的免疫球蛋白G各亚型糖肽单体分别进行PNGase F去糖基化反应，从而得到去糖基化的免疫球蛋白G肽段酶解液； 6)去糖基化免疫球蛋白G糖肽肽段定量分析：将步骤5)中免疫球蛋白G糖肽的PNGase F酶解液进行HPLC-MRM定量分析；具体地，先建立免疫球蛋白G亚型的内标曲线；采用所述免疫球蛋白G各亚型糖肽对应肽段标准品(购买)，稀释成至少5个不同浓度，浓度范围为20ppb-200ppm，每个浓度的标准品均加入2ppm与各标准品等体积的与亚型对应的内标肽段，所述内标肽段与标准品的区别在于内标肽段在上述液相分离条件下具有与标准品相似保留行为；随后进行HPLC-MRM定量分析，建立与上述亚型对应的内标曲线，曲线纵坐标为上述不同浓度的标准品峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，横坐标为上述标准品的摩尔浓度；而后，将步骤5)IgG各亚型糖肽酶解液中加入与该酶解液等体积的2ppm所述IgG各亚型糖肽对应内标肽段，进行HPLC-MRM定量分析，测定免疫球蛋白G各亚型糖肽肽段峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，将此比值带入内标曲线，得到各亚型每种糖肽肽段摩尔浓度，即为每种纯化糖肽单体的摩尔浓度； 7)血清中免疫球蛋白G目标糖肽根据标准添加法定量分析：将血清样品进行Trypsin酶解，将酶解液均分两份：一份酶解液种添加已知浓度(Ca)的步骤3)纯化的糖肽标准品后进行HPLC-MRM定量分析，得到目标糖型糖肽添加后峰面积Aa；另一份酶解液直接进行HPLC-MRM IgG糖肽定量分析，得到目标糖型糖肽未添加峰面积Ab，根据标准添加的峰面积和浓度的关系，见下公式，计算血清中目标糖型糖肽摩尔浓度Ci； 2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤1)将血清稀释并加入二硫苏糖醇进行二硫键还原反应，反应温度在37-90℃之间，反应时间在50-180min；加入碘代乙酸反应温度在20-30℃之间，反应时间在30-60min；加入胰蛋白酶后反应温度在35-40℃之间，反应时间在18-72h；步骤1)血清酶解稀释所使用的缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲溶液，稀释所用缓冲液浓度在50-400mM，pH为7-8，加入原溶液体积的1-3倍体积的缓冲溶液；加入二硫苏糖醇的浓度在0.3-0.6M，血清总蛋白与二硫苏糖醇的质量比例为7:1-3:1；加入碘代乙酸的浓度在0.3-0.6M，血清总蛋白与碘代乙酸的质量比为5.5:1-2.7:1；加入胰蛋白酶和血清总蛋白的质量比为1:50-1:20；酶解后，加入1％-5％(v/v)甲酸终止酶解反应；步骤2)富集所用色谱柱为XAqua C18色谱柱；所用色谱柱键合材料的粒径为5-10μm，采用4.6150mm色谱柱，流动相为甲醇与水或乙腈与水，两相中均含有或不含有0.1％(v/v)甲酸；洗脱条件按照水相95-70％(v/v)等度或5-60分钟水相由98％(v/v)变化到70％(v/v)线性梯度进行；使用紫外检测器，检测波长为190-280nm；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.6-1.2mL/min，收集保留时间为5-15min的组分；步骤2)免疫球蛋白G糖肽富集时采用最佳流动相为乙腈和水，两相中均含或不含0.1％(v/v)甲酸，等度洗脱，水在流动比例为98-80％(v/v)；步骤2)免疫球蛋白G富集到的糖肽馏分采用nano-ESI-Q-TOF-MS直接进样检测，正离子模式，喷雾电压2.5kV，扫描范围500-2000，流速1μL/min，进样5μL。 3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤3)一维纯化采用硅胶基质键合材料为色谱柱填料Mal，此材料为极性共聚亲水填料；所用色谱柱基质键合材料的粒径为5-10μm，采用4.6150mm色谱柱，流动相为甲醇与水或乙腈与水混合，两相中均含有或不含有0.1％(v/v)甲酸；洗脱条件按照水相15-50％(v/v)等度或5-60分钟水相由10％(v/v)变化到60％(v/v)线性梯度进行；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.7-1mL/min；二维分离纯化条件为：采用硅胶基质键合材料为色谱柱填料XIon，此材料为极性共聚亲水填料；所用色谱柱基质键合材料的粒径为5-10μm，采用2.1150mm色谱柱，流动相为甲醇与水或乙腈与水混合，两相中均含有或不含有0.1％(v/v)甲酸；洗脱条件按照水相15-50％(v/v)等度或5-60分钟水相由10％(v/v)变化到60％(v/v)线性梯度进行；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.2mL/min；在步骤4)中，将步骤3)中收集的IgG糖肽馏分进行MALDI-TOF质谱表征，采用正离子模式，反射模式进行表征分析。 4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：在步骤5)中，取出已知体积的步骤3)中收集的免疫球蛋白G糖肽单体先经低温离心浓缩仪在8℃旋干处理后，进行PNGase F酶解反应，糖链释放使用碳酸氢铵缓冲溶液，体积50-200μL，浓度为50-200mM，pH为7-9；酶解反应温度为35-40℃；反应时间为10-36小时；加入PNGase F的量为每1-10mg免疫球蛋白糖肽加入1unit酶量。 5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤6)HPLC-MRM定量分析液相部分以硅胶基质键合材料为色谱柱填料XAqua C18，此材料为反相填料；所用色谱柱基质键合材料的粒径为5-10μm，采用2.1100mm色谱柱，流动相为甲醇与水或乙腈与水，两相中均含有或不含有0.1％(v/v)甲酸；洗脱条件按照水相85-50％(v/v)等度或5-10分钟水相由98％(v/v)变化到10％(v/v)线性梯度进行；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.2-0.6mL/min；质谱条件为：Q-Trap 5000串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有Waters UPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。 6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤6)中所述内标肽段为： IgG1内标肽段氨基酸序列为EEQYESTYR， IgG2内标肽段氨基酸序列为EEQFESTFR， IgG3和IgG4内标肽段氨基酸序列为EEQYESTFR；所述免疫球蛋白G亚型中糖肽的对应肽段的标准品为： IgG1为EEQYDSTYR， IgG2为EEQFDSTFR， IgG3为EEQYDSTFR， IgG4为EEQFDSTYR。 7.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤7)将血清稀释并加入二硫苏糖醇进行二硫键还原反应，反应温度在37-90℃之间，反应时间在50-180min；加入碘代乙酸反应温度在20-30℃之间，反应时间在30-60min；加入胰蛋白酶后反应温度在35-40℃之间，反应时间在18-72h；步骤7)血清酶解稀释所使用的缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲溶液，稀释所用缓冲液浓度在50-400mM，pH为7-8，加入原溶液体积的1-3倍体积的缓冲溶液；加入二硫苏糖醇的浓度在0.3-0.6M，血清总蛋白与二硫苏糖醇的质量比例为7:1-3:1；加入碘代乙酸的浓度在0.3-0.6M，血清总蛋白与碘代乙酸的质量比为5.5:1-2.7:1；加入胰蛋白酶和血清总蛋白的质量比为1:50-1:20；酶解后，加入1％-5％(v/v)甲酸终止酶解反应。 8.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤7)HPLC-MRM定量分析液相部分以硅胶基质键合材料为色谱柱填料XAqua C18，此材料为反相填料；所用色谱柱基质键合材料的粒径为5-10μm，采用2.1*100mm色谱柱流动相为甲醇与水或乙腈与水，两相中均含有或不含有0.1％(v/v)甲酸；洗脱条件按照水相85-50％(v/v)等度或5-10分钟水相由98％(v/v)变化到10％(v/v)线性梯度进行；柱温为25-35℃，洗脱液流速为0.2-0.6mL/min；质谱条件为：Q-Trap 5500串联四级杆线性离子阱高性能质谱仪，配有Waters UPLC液相、AB SCIEX质谱和Analyst 1.6.1数据处理软件；离子源：Turbo Ion Spray；正离子扫描方式检测；扫描方式为多反应监测；全扫分辨率14000，最大注入时间200ms。 9.按照权利要求1所述方法，其特征在于，可以同时对IgG1、IgG2或IgG3和IgG4之和(IgG3/4)的一种或两种以上中的糖肽进行绝对定量。 10.使用权利要求1-9任意一种方法定量测定实际人血液样品免疫球蛋白G糖肽的应用，其特征在于能够定量测出血清中免疫球蛋白G高丰度糖肽的含量，浓度0.1pmol/mL-10nmol/mL。
所属类别：	发明专利