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原文传递基于免疫磁性分离的链格孢酚单甲醚微流控检测芯片及检测方法

专利名称：	基于免疫磁性分离的链格孢酚单甲醚微流控检测芯片及检测方法
摘要：	本发明提供一种基于免疫磁性分离的链格孢酚单甲醚微流控检测芯片及检测方法。所述微流控检测芯片包括依次叠放在一起并相互密封的三层结构，由上至下分别为盖片层、中间层和基板层；中间层上设有若干条平行独立的流体通道，每条流体通道上设有样本进口和样本出口，所述样本进口、样本出口分别对应于盖片层上的进样口、出液口；所述流体通道上依次设有反应腔室A、微混合区和反应腔室B；反应腔室A内放有GNP‑mAbs耦合垫，反应腔室B内含有磁珠‑BSA‑AME复合物。本发明以磁珠‑BSA‑AME为捕获探针，GNP‑mAbs为检测探针，利用磁珠的磁性进行快速分离后，上清中游离的GNP‑mAbs经自身的催化快速均相增长进行信号放大该方法具有简单、快速、灵敏、高通量的特性，可以实现果蔬样品中AME的定量检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京农业质量标准与检测技术研究中心
发明人：	满燕;潘立刚;李安;靳欣欣
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-08T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-18T00:00:00+0800
申请号：	CN201910276671.3
公开号：	CN109900899A
代理机构：	北京路浩知识产权代理有限公司
代理人：	王文君;黄爽
分类号：	G01N33/543(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	100097 北京市海淀区曙光花园中路9号北京市农林科学院质标中心
主权项：	1.基于免疫磁性分离的链格孢酚单甲醚微流控检测芯片微流控检测芯片，其特征在于，所述微流控检测芯片包括依次叠放在一起并相互密封的三层结构，由上至下分别为盖片层、中间层和基板层；其中，所述盖片层上设有若干个进样口和出液口，所述进样口、出液口各自独立地贯通盖片层和中间层；所述中间层上设有若干条平行独立的流体通道，每条流体通道上设有样本进口和样本出口，所述样本进口对应于所述盖片层上的进样口，所述样本出口对应于所述盖片层上的出液口；所述流体通道沿着样本进口至样本出口的方向依次设有反应腔室A、微混合区和反应腔室B；所述反应腔室A内放置有胶体金-AME单抗复合物耦合垫，所述反应腔室B内添加有磁珠-BSA-AME复合物。 2.根据权利要求1所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述盖片层和中间层的材质为NOA81光胶或PDMS；和/或所述基板层为玻璃基片或PDMS基板；和/或所述耦合垫的材质为玻璃纤维素膜。 3.根据权利要求1所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述中间层内的微混合区为Z字型微流体混合通道；和/或所述耦合垫上包被有浓缩6.7倍的胶体金-AME单抗复合物6μL，所述反应腔室B内加入3mg/mL的磁珠-BSA-AME复合物15μL。 4.根据权利要求1-3任一项所述的微流控检测芯片，其特征在于，所述芯片的长度为65mm，宽度为43mm；所述盖片层和中间层的厚度为0.5mm；和/或所述流体通道的深度、长度和宽度分别为0.5mm、43mm和150μm。 5.权利要求1-4任一项所述微流控检测芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： a、胶体金-AME单抗复合物耦合垫的制备：将胶体金-AME单抗复合物溶液重悬于Tris-HCl缓冲液中，得到浓缩6.7倍的胶体金-AME单抗复合物；取6μL滴加于3mm直径的玻璃纤维素膜上，37℃条件下烘干1h，即得； b、磁珠-BSA-AME复合物的制备 b1、磁珠的制备将2.7g FeCl3·6H2O和1.39g FeSO4·7H2O加入50mL水中，80℃条件下搅拌15min；加入4mL 30％氨水，继续搅拌30min；用水和无水乙醇各清洗3次后，120℃干燥60min； b2、磁珠氨基化修饰取b1制备的磁珠100mg在超声条件下分散于20mL无水乙醇中，超声40min；然后加入200μL水和1mL APTES，室温条件下孵育过夜；用水清洗后，将制备的氨基化磁珠复溶于8mL水中； b3、磁珠醛基化修饰取b2制备的氨基化磁珠1mL重悬于50mM，pH 8.0的PB缓冲液1mL中；加入0.5mL戊二醛，室温条件下孵育2h；用所述PB缓冲液清洗后，重悬于1mL所述PB缓冲液中； b4、磁珠-BSA-AME复合物的制备将40μL 10mg/mL的AME-BSA加入到b3制备的醛基化磁珠1mL中，室温条件下孵育过夜；然后加入120μL 50mg/mL的BSA溶液，室温条件下孵育1h；用所述PB缓冲液清洗后，重悬于5mL所述PB缓冲液中，即得； c、微流控芯片的制作及组装 c1、中间层的制备用水和无水乙醇清洗玻璃基片，氮气吹干，将掩膜框固定于玻璃基片上；将0.4mLNOA81光胶滴加于掩膜框内，然后，将带有流体通道结构的掩膜盖住NOA81光胶；紫外曝光后，将掩膜和掩膜框撕下，用丙酮和无水乙醇的混合液洗掉未固化的NOA81光胶，冷风吹干； c2、盖片层的制备将掩膜框固定于铬版，滴加0.3mL NOA81光胶，将上层掩膜盖在NOA81光胶上；紫外曝光后，将掩膜、掩膜框和NOA81光胶层从铬版上撕下；洗掉未固化的光胶，去除掩膜框； c3、纳米材料的嵌入将步骤a制备的胶体金-AME单抗复合物耦合垫和步骤b制备的磁珠-BSA-AME复合物分别加入到反应腔室A和反应腔室B内； c3、微流控检测芯片的键合利用UV固化技术，将盖片层掩膜上的光胶与中间层的光胶进行固定，撕掉上层掩膜，即得；其中，步骤a所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10mM，pH7.4，含有1％BSA，5％蔗糖，0.05％PEG20000和0.1％Tween-20；步骤c所述丙酮和无水乙醇混合液中丙酮和无水乙醇的体积比为4:1。 6.基于免疫磁性分离的链格孢酚单甲醚微流控检测系统，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的微流控检测芯片、磁铁、进液管、出液管、均相免疫金增长液、酶标仪和蠕动泵；其中，所述均相免疫金增长液的制备如下：将182.2mg CTAB和0.1M HAuCl4溶液12.5μL加入到5mL纯水中，37℃孵育至体系变为澄清的浅黄色；然后加入100mM抗坏血酸75μL，将混合液冷却至室温，即得。 7.权利要求1-4任一项所述微流控检测芯片，或权利要求6所述系统在链格孢酚单甲醚免疫检测中的应用。 8.基于免疫磁性分离的链格孢酚单甲醚微流控检测方法，其特征在于，包括以下步骤： S1、将样品研磨成浆，向5g浆液中加水至5mL，得到样品溶液； S2、向样品溶液中加入20mL含100mM柠檬酸的乙腈，室温条件下搅拌孵育30min后，加入2g氯化钠，10000rpm离心5min，取上清液，上清液经固相萃取小柱纯化；取4mL萃取液进行氮气干燥后，加入0.1mL乙腈复溶，然后加入10mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲液1mL，制得样本液，已备检测； S3、在蠕动泵的作用下，将样本液从进样口注入到权利要求1-4任一项所述微流控检测芯片中，依次流经反应腔室A、微混合区和反应腔室B，进行磁分离后，收集从出液口流出的液体；将30μL液体加入到100μL均相免疫金增长液中，室温孵育10min后，加入10μL 10mMNa2S2O3溶液，用酶标仪在400-800nm波长范围下进行紫外检测，测得吸光度值； S4、配制不同浓度梯度的链格孢酚单甲醚标准品溶液，按照步骤S2-S3进行检测，根据标准品溶液的浓度及相应的吸光度值绘制标准曲线； S5、根据样品溶液的检测结果，对照标准曲线，获得样品溶液中链格孢酚单甲醚的浓度，从而计算出样品中链格孢酚单甲醚的含量；其中，所述均相免疫金增长液的定义同权利要求6中所述。 9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，链格孢酚单甲醚的线性检测范围：12.5-200pg/mL，最低检测限：12.5pg/mL。 10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述样品包括水果和蔬菜。
所属类别：	发明专利