详情

原文传递链格孢酚单甲醚的磁免疫荧光定量检测方法

专利名称：	链格孢酚单甲醚的磁免疫荧光定量检测方法
摘要：	本发明提供链格孢酚单甲醚(AME)的磁免疫荧光定量检测方法，其是一种基于H2O2介导CdTe QDs荧光淬灭的磁免疫分析新方法。由过氧化氢酶(CAT)‑AME作为竞争性抗原，与样品中的AME竞争性结合磁珠上的单克隆抗体，经磁分离后，上清中剩余的CAT‑AME对H2O2进行降解，因此降低了H2O2对巯基丙酸量子点(MPA‑CdTe QDs)的荧光淬灭率，并根据此原理来判断样品中AME的含量。利用本方法可以简单、快速地实现果蔬样本中AME的定量检测，最低检测限可达0.25pg/mL。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京农业质量标准与检测技术研究中心
发明人：	满燕;潘立刚;靳欣欣
专利状态：	有效
申请日期：	2018-12-25T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-24T00:00:00+0800
申请号：	CN201811595181.1
公开号：	CN109799332A
代理机构：	北京路浩知识产权代理有限公司
代理人：	王文君;黄爽
分类号：	G01N33/531(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	100097 北京市海淀区曙光花园中路9号
主权项：	1.链格孢酚单甲醚的磁免疫荧光定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤： A、Fe3O4磁珠-AME单抗复合物溶液的制备； B、CAT-AME复合物溶液的制备； C、巯基丙酸修饰的碲化镉量子点溶液的制备； D、不同浓度的AME标准品溶液的制备； E、将不同浓度的AME标准品溶液分别与A制备的Fe3O4磁珠-AME单抗复合物溶液和B制备的CAT-AME复合物溶液混合孵育一段时间后，进行磁分离，将上清液转移至离心管中，加入一定浓度的过氧化氢溶液，孵育一段时间后，将反应混合物加入C制备的的巯基丙酸修饰的碲化镉量子点溶液中，避光反应一段时间后，检测产物的荧光强度，建立反映荧光强度与AME浓度之间关系的标准曲线； F、将E中不同浓度的AME标准品溶液替换成待测样品溶液，按照相同的方法进行检测，将检测到的荧光强度代入上述标准曲线，计算得出待测样品溶液中AME含量。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，A具体为： A1、Fe3O4磁珠的制备：5.4g FeCl3·6H2O和2.78g FeSO4·7H2O加入到100mL水中，80℃条件下搅拌20min；加入30％氨水8mL，继续搅拌30min；用水和乙醇清洗后干燥，即得Fe3O4磁珠； A2、Fe3O4磁珠的氨基化修饰：将100mg A1制备的磁珠在超声条件下分散于25mL无水乙醇；加入200μL水和1mL APTES，室温条件下孵育过夜；用水清洗后，将制备的氨基化磁珠复溶于8mL水中，得到氨基化的磁珠溶液； A3、Fe3O4磁珠的醛基化修饰：取1mL A2制备的磁珠溶液复溶于1mL PB缓冲液中；加入0.5mL戊二醛，室温条件下孵育4h；用所述PB缓冲液清洗后重悬于1mL所述PB缓冲液中，得到醛基化的磁珠溶液；其中，所述PB缓冲液的浓度为50mM，pH 8.0； A4、Fe3O4磁珠-AME单抗复合物溶液的制备：将100μL 2.7mg/mL的AME单克隆抗体加入到1mL A3制备的醛基化的磁珠溶液中，室温条件下孵育过夜；加入200μL 50mg/mL的BSA溶液，室温条件下孵育2h；经Tris-HCl缓冲液清洗后，重悬于10mL Tris-HCl缓冲液中，即得Fe3O4磁珠-AME单抗复合物溶液；其中，Tris-HCl缓冲液的浓度为10mM，pH 8.0。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，B具体为： B1、羧基化AME溶液的制备：将100mg AME溶于5mL DMF，加入75mg溴丁酸甲酯和150mg碳酸钾，50℃搅拌反应2h，加入10mL水稀释，然后用10mL乙酸乙酯进行萃取，有机相经浓缩后，得到100mg甲酯修饰的AME；取75mg甲酯修饰的AME和9mg氢氧化锂溶解于由2.5mL的甲醇和2.5mL的四氢呋喃组成的混合液中，然后加入0.5mL水；将该混合溶液室温下搅拌孵育5h；有机相经浓缩后，残留物用2.5mL水进行稀释；将该稀释液的pH调至4.0，用5mL乙酸乙酯进行萃取，有机相经浓缩后得到羧基化AME溶液； B2、CAT-AME复合物溶液的制备：将2mg EDC和1.6mg的NHS溶解于0.02mL 0.25mg/mL B1制备的羧基化AME溶液中，室温条件下孵育5h，得到溶液I；然后将4mg CAT溶解于2mL Tris-HCl溶液中，得到CAT溶液；将所述CAT溶液逐滴加入上述溶液I中，室温下搅拌12h；然后离心去除沉淀，上清液用Tris-HCl缓冲液透析72h，每12h更换一次透析液，即得CAT-AME复合物溶液；其中，Tris-HCl溶液的浓度为10mM，pH 8.0；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10mM，pH8.0。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，C具体为： C1、将127.5mg Te和80mg NaBH4加入5mL去离子水中，连续搅拌4h后，将该混合液置于冰上冷却，5000rpm离心10min后，收集上清液即为NaHTe溶液； C2、在搅拌条件下，将硝酸镉和巯基丙酸混合，并用氢氧化钠溶液调节该混合溶液的pH至11，得到硝酸镉前驱体溶液； C3、将C1制备的NaHTe溶液加入到经氮气饱和的硝酸镉前驱体溶液中，使NaHTe、硝酸镉和巯基丙酸的终浓度分别为0.8、1.7和2.5mg/mL，95℃条件下加热20min后，即得巯基丙酸修饰的碲化镉量子点溶液。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，D具体为：用12.5mM pH 7.0的Tri-HCl液将AME标准品配制成不同浓度。 6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，E具体为： E1、将100μL不同浓度的AME标准品溶液分别与15μL A制备的Fe3O4磁珠-AME单抗复合物溶液和B制备的CAT-AME复合物溶液在37℃下孵育30min；其中，混合体系中CAT-AME复合物的终浓度为12nM； E2、孵育结束进行磁分离，将上清液转移至离心管中，加入21μM过氧化氢溶液，37℃下继续孵育30min； E3、将E2的反应混合物加入C制备的100μL巯基丙酸修饰的碲化镉量子点溶液中，避光室温条件下反应20min后，检测产物的荧光强度。 7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，E中利用多功能酶标仪检测产物的荧光强度，激发波长为310nm，发射波长为599nm。 8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，AME的线性检测范围是0.25-7.5pg/mL，最低检测限为0.25pg/mL。 9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，F中还包括对待测样品进行前处理的步骤，具体为：将样品研磨成浆，或向样品中加水研磨成浆，向5mL浆液中加入20mL含100mM柠檬酸的乙腈溶液，室温条件下搅拌孵育30min后，加入2g氯化钠，10000rpm离心5min，取上清液经固相萃取柱纯化，收集透过液，经氮气干燥后，重新溶于0.1mL乙腈中，得到待测样品溶液。
所属类别：	发明专利