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原文传递一种舒肝宁注射液HPLC指纹图谱的建立方法

专利名称：	一种舒肝宁注射液HPLC指纹图谱的建立方法
摘要：	本发明公开了一种舒肝宁注射液HPLC指纹图谱的建立方法，本发明针对灵芝提取物中成分极性较大的特点，建立了针对灵芝提取物的注射液成品指纹图谱，对流动相、检测波长等高效液相色谱条件进行优化，并进行了全面的方法学考察，通过系统研究可以看出从灵芝药材、灵芝提取物到成品制剂的特征成分峰具有较好的相关性，灵芝的特有化学成分能够转移到成品制剂中，该指纹图谱能较好地体现灵芝的特有成分，用该方法还能较为全面地反映舒肝宁注射液中所含化学成分的种类与数量，进而对其质量进行整体描述和评价，且用该方法检测到的舒肝宁注射液指纹图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度、峰形和柱效好。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	贵州;52
申请人：	贵州瑞和制药有限公司
发明人：	赵云;张昀;何峰;原勤;熊毅刚
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-01T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-25T00:00:00+0800
申请号：	CN201910157635.5
公开号：	CN109932441A
代理机构：	北京联创佳为专利事务所(普通合伙)
代理人：	张梅
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	551200 贵州省黔南布依族苗族自治州龙里县谷脚镇香樟岩
主权项：	1.一种舒肝宁注射液HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述舒肝宁注射液按重量份计算，主要由茵陈提取物3-5份、栀子提取物2-4份、黄芩苷20-24份、板蓝根提取物4-6份和灵芝提取物3-4份按下述方法制备而成：以上五味，取黄芩苷加8-12倍量注射用水混悬，加10％氢氧化钠溶液使溶解；其余茵陈提取物等四味，分别加8-12倍量注射用水溶解，混匀，加0.2％活性炭，搅匀，煮沸15分钟，滤过，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至7.5～8.0，加注射用水至1000体积份，滤过，灌封，灭菌，即得；所述HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤： (1)参照物溶液的制备：取腺苷对照品、胸苷对照品、灵芝酸A对照品、灵芝酸B对照品、赤芝酸A对照品、胞苷对照品、尿苷对照品、鸟苷对照品、虫草素对照品、2-脱氧核苷对照品，精密称定，分别加水制成每1ml含腺苷0.8-1.2mg/ml、胸苷0.8-1.2mg/ml、灵芝酸A 0.8-1.2mg/ml、灵芝酸B 0.8-1.2mg/ml、赤芝酸A 0.8-1.2mg/ml、胞苷0.8-1.2mg/ml、尿苷0.8-1.2mg/ml、鸟苷0.8-1.2mg/ml、虫草素0.8-1.2mg/ml、2-脱氧核苷0.8-1.2mg/ml的溶液； (2)腺苷对照品溶液的制备：精密称取腺苷对照品8-10mg，加水溶解并定容至10ml，既得； (3)胸苷对照品溶液的制备：精密称取胸苷对照品8-10mg，加水溶解并定容至10ml，既得； (4)灵芝酸A对照品溶液的制备：精密称取灵芝酸A对照品10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得； (5)灵芝酸B对照品溶液的制备：精密称取灵芝酸B对照品8-10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得； (6)赤芝酸A对照品溶液的制备：精密称取赤芝酸A对照品8-10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得； (7)胞苷对照品溶液的制备：精密称取胞苷对照品8-10mg，加水溶解并定容至10ml，既得； (8)尿苷对照品溶液的制备：精密称取尿苷对照品8-10mg，加水溶解并定容至10ml，既得； (9)鸟苷对照品溶液的制备：精密称取鸟苷对照品8-10mg，加水5ml混匀后加入0.1ml氨水溶解，并用水定容至刻度，既得； (10)虫草素对照品溶液的制备：精密称取虫草素对照品8-10mg，加水溶解并定容至10ml，既得； (11)2-脱氧核苷对照品溶液的制备：精密称取2-脱氧核苷对照品8-10mg，加水溶解并定容至10ml，既得； (12)混合参照物溶液①的制备：精密吸取腺苷对照品溶液、胸苷对照品溶液、灵芝酸A对照品溶液、灵芝酸B对照品溶液、赤芝酸A对照品溶液各1ml混匀后加水定容至5ml，即各参照物浓度为0.2mg/ml； (13)混合参照物溶液②的制备：精密吸取胞苷对照品溶液、尿苷对照品溶液、鸟苷对照品溶液、虫草素对照品溶液、2-脱氧核苷对照品溶液各1ml混匀后加水定容至5ml，即各参照物浓度为0.2mg/ml； (14)供试品溶液的制备：精密吸取舒肝宁注射液5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得； (15)指纹图谱的制作：色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱ECOSIL HPLC COLUMN-C18，5μm，4.6×250mm；以乙腈为流动相A，0.1％醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；梯度洗脱程序为：0～10min，100％B；10～15min，100％→97％(B)；15～30min，97％→80％(B)；30～90min，80％→50％(B)；90～105min，50％(B)；流速为每分钟1ml；检测波长为254nm；柱温为35℃；理论板数按腺苷峰计算应不低于3000；分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录105分钟的色谱图，即可得到舒肝宁注射液的HPLC指纹图谱； (16)标准指纹谱图的确认：按照上述提供的方法，对多批次舒肝宁注射液建立了HPLC指纹图谱，通过分析比较确定了5个共有峰，这些共有峰构成了舒肝宁注射液的指纹特征，作为舒肝宁注射液的标准指纹图谱。 2.如权利要求1所述的舒肝宁注射液HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述舒肝宁注射液按重量份计算，主要由茵陈提取物4份、栀子提取物3份、黄芩苷22份、板蓝根提取物5份和灵芝提取物3.5份按下述方法制备而成：以上五味，取黄芩苷加10倍量注射用水混悬，加10％氢氧化钠溶液使溶解；其余茵陈提取物等四味，分别加10倍量注射用水溶解，混匀，加0.2％活性炭，搅匀，煮沸15分钟，滤过，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至7.5～8.0，加注射用水至1000体积份，滤过，灌封，灭菌，即得；所述HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤： (1)参照物溶液的制备：取腺苷对照品、胸苷对照品、灵芝酸A对照品、灵芝酸B对照品、赤芝酸A对照品、胞苷对照品、尿苷对照品、鸟苷对照品、虫草素对照品、2-脱氧核苷对照品，精密称定，分别加水制成每1ml含腺苷1mg/ml、胸苷1mg/ml、灵芝酸A 1mg/ml、灵芝酸B 1mg/ml、赤芝酸A 1mg/ml、胞苷1mg/ml、尿苷1mg/ml、鸟苷1mg/ml、虫草素1mg/ml、2-脱氧核苷1mg/ml的溶液； (2)腺苷对照品溶液的制备：精密称取腺苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得； (3)胸苷对照品溶液的制备：精密称取胸苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得； (4)灵芝酸A对照品溶液的制备：精密称取灵芝酸A对照品10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得； (5)灵芝酸B对照品溶液的制备：精密称取灵芝酸B对照品10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得； (6)赤芝酸A对照品溶液的制备：精密称取赤芝酸A对照品10mg，加甲醇溶解并定容至10ml，既得； (7)胞苷对照品溶液的制备：精密称取胞苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得； (8)尿苷对照品溶液的制备：精密称取尿苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得； (9)鸟苷对照品溶液的制备：精密称取鸟苷对照品10mg，加水5ml混匀后加入0.1ml氨水溶解，并用水定容至刻度，既得； (10)虫草素对照品溶液的制备：精密称取虫草素对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得； (11)2-脱氧核苷对照品溶液的制备：精密称取2-脱氧核苷对照品10mg，加水溶解并定容至10ml，既得； (12)混合参照物溶液①的制备：精密吸取腺苷对照品溶液、胸苷对照品溶液、灵芝酸A对照品溶液、灵芝酸B对照品溶液、赤芝酸A对照品溶液各1ml混匀后加水定容至5ml，即各参照物浓度为0.2mg/ml； (13)混合参照物溶液②的制备：精密吸取胞苷对照品溶液、尿苷对照品溶液、鸟苷对照品溶液、虫草素对照品溶液、2-脱氧核苷对照品溶液各1ml混匀后加水定容至5ml，即各参照物浓度为0.2mg/ml； (14)供试品溶液的制备：精密吸取舒肝宁注射液5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得； (15)指纹图谱的制作：色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱ECOSIL HPLC COLUMN-C18，5μm，4.6×250mm；以乙腈为流动相A，0.1％醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；梯度洗脱程序为：0～10min，100％B；10～15min，100％→97％(B)；15～30min，97％→80％(B)；30～90min，80％→50％(B)；90～105min，50％(B)；流速为每分钟1ml；检测波长为254nm；柱温为35℃；理论板数按腺苷峰计算应不低于3000；分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录105分钟的色谱图，即可得到舒肝宁注射液的HPLC指纹图谱； (16)标准指纹谱图的确认：按照上述提供的方法，对多批次舒肝宁注射液建立了HPLC指纹图谱，通过分析比较确定了5个共有峰，这些共有峰构成了舒肝宁注射液的指纹特征，作为舒肝宁注射液的标准指纹图谱。 3.如权利要求1或2所述的舒肝宁注射液HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述5个共有峰，以5号峰腺苷为参照峰，其相对保留时间分别为0.4377-0.4448、0.5251-0.5343、0.6247-0.6358、0.9429-0.9519、1.0000。
所属类别：	发明专利