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原文传递基于辅酶A适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用

专利名称：	基于辅酶A适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用
摘要：	本发明公开了基于辅酶A适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用。首先，将CoA适配体(CoA‑aptamer)通过Au‑S作用修饰到电极表面，当乙酰化反应溶液加入到电极表面后，由于生成的CoA与其适配体的特异性结合作用，阻碍了核酸外切酶(Exo I)水解，再通过末端转移酶(TdT)延长形成富C DNA链并制备银纳米簇(AgNCs)，进而通过Ag的溶出伏安信号间接实现HAT p300活性检测。如果乙酰化反应没有发生，CoA‑aptamer保持单链状态，且能够被ExoI水解，不产生电化学信号。该传感器可以用来检测HATp300活性并筛选其小分子抑制剂。由此发明出一种操作简单、方便快捷、超灵敏准确的HATp300活性检测的电化学分析方法。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	宁波大学
发明人：	胡宇芳;胡丹丹;张青青;马少华;王邃;郭智勇
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-21T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-25T00:00:00+0800
申请号：	CN201910096691.2
公开号：	CN109932408A
分类号：	G01N27/327(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	315211 浙江省宁波市江北区风华路818号宁波大学
主权项：	1.基于辅酶A适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用，其特征在于，机理如下：将CoA适配体(CoA-aptamer)通过Au-S作用修饰到电极表面，当乙酰化反应溶液加入到电极表面后，由于生成的CoA与其适配体的特异性结合用，阻碍了核酸外切酶(Exo I)水解，再通过末端转移酶(TdT)延长形成富C DNA链并制备银纳米簇(AgNCs)，进而通过Ag的溶出伏安信号间接实现HAT活性检测。如果乙酰化反应没有发生，CoA-aptamer保持单链状态，且能够被核酸外切酶(Exo I)水解，不产生电化学信号。HAT p300浓度变化会影响电化学传感器的电化学响应。 2.基于辅酶A适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用，其特征在于，具体包括如下步骤： Electrode 1的制备：将金电极(直径为2mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末抛光2～5min，抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗2～5min，然后用N2吹干，取CoA-aptamer溶液(2～5μL，0.1～0.5μM)，80～90℃下加热5～10min，然后逐渐冷却至室温，滴涂于电极表面，在4℃冰箱孵育过夜，蒸馏水缓缓冲洗电极，采用巯基己醇(MCH，2～5μL，0.5～1.0mM)处理30～60min，置换电极表面非Au-S键固定的CoA-aptamer，蒸馏水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 1。 Electrode 2的制备：依次取Ac-CoA(0.1～1μL，0.1～1mM)，多肽(0.1～1μL，0.1～1mM)，HAT p300(0.1～1μL，0.01～500nM)，加H2O至总体积2～5μL。搅拌器上剧烈搅拌2～5min至混合均匀，然后移至温度为32～40℃的水浴锅中孵育1～3h，稀释10倍备用。取2～5μL乙酰化反应液滴涂于Electrode 1表面，在32～40℃孵育30～60min，而后蒸馏水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 2。 Electrode 3的制备：取Exo I溶液(2～5μL，0.5～1.0U/μL)滴涂于Electrode 2表面，在室温下孵育30～120min，而后蒸馏水缓缓冲洗电极。再滴加2～10μL TdT反应液(组成为：1～5μL 5×TdT缓冲液，dCTP(1～3μL，5～10mM)，TdT(1～3μL，5～10U/mL)，标记为Electrode 3。 Electrode 4的制备：向Electrode 3电极表面滴加Ag+(2～5μL，1～3μM)，室温孵育15～30min，蒸馏水缓缓冲洗电极，再向电极表面滴加硼氢化钠溶液(NaBH4，2～5μL，1～3μM)，室温下避光反应15～30min，蒸馏水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 4。 3.根据权利要求1和权利要求2所述的基于辅酶A适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用，其特征在于：所用CoA-aptamer序列结构为(5’-3’)：GGGCACGAGCGAAGGGCATAAGCTGACGAAAGTCAGACAAGACATGGTGCCC。 4.根据权利要求1和权利要求2所述的基于辅酶A适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用，其特征在于：用来检测HAT p300的电化学方法为Ag溶出伏安法，电位范围为0.05～0.25V，振幅为25mV。 5.根据权利要求1和权利要求2所述的基于辅酶A适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用，其特征在于：本发明传感器，可以实现不同浓度HAT p300检测及其小分子抑制剂的筛选，检测限为0.005nM，其小分子抑制剂漆树酸的半抑制浓度为28.50μM，C646的半抑制浓度为3.62μM。
所属类别：	发明专利