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原文传递呼吸道病原体检测方法

专利名称：	呼吸道病原体检测方法
摘要：	本发明公开了一种呼吸道病原体检测方法，包括以下步骤：1）对给定的呼吸道病原样本进行蛋白提取；2）以步骤1）提取到的蛋白为蛋白样本形成RPPA；3）对步骤2）获得的RPPA通过PWG进行微生物或病毒检测；其中，RPPA为Reverse Phase Protein Array，即反相蛋白阵列；PWG为Planar Wave Guide，即平面光导。依据本发明呼吸道病原体检测方法在样本中所含蛋白量相对较少时不容易产生漏检。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江大学
发明人：	陈瑜;王楠;郑书发;楼滨
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-04T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-25T00:00:00+0800
申请号：	CN201910160836.0
公开号：	CN109932513A
代理机构：	山东众成清泰律师事务所
代理人：	丁修亭
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号
主权项：	1.一种呼吸道病原体检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 1）对给定的呼吸道病原样本进行蛋白提取； 2）以步骤1）提取到的蛋白为蛋白样本形成RPPA； 3）对步骤2）获得的RPPA通过PWG进行微生物或病毒检测；其中，RPPA为Reverse Phase Protein Array ，即反相蛋白阵列； PWG为Planar Wave Guide，即平面光导。 2.根据权利要求1所述的呼吸道病原体检测方法，其特征在于，蛋白提取的方法为：针对痰液： t1）将痰液样本震荡混匀； t2）在痰液样本中加入裂解液，然后混合均匀，获得混合液； t3）对步骤t2）获得的混合液进行温育； t4）对温育后的混合液进行离心分离，取上清，即获得蛋白样本；针对咽拭子，第一提取方法： y11）取下咽拭子头，置于EP管内； y12）加入裂解液，裂解液完全淹没咽拭子头部； y13）对浸入裂解液的咽拭子头进行温育，促咽拭子头上的起始样本裂解； y14）将温育后的EP管置于离心机进行离心分离，取出咽拭子头，保留上清液，即获得蛋白样本；针对咽拭子，第二提取方法： y21）取下咽拭子头，将咽拭子头浸入病毒培养液中，混匀； y22）取新咽拭子，蘸取步骤y21）中的病毒培养液，新咽拭子头吸收饱和后取下，置于EP管内； y33）向EP管内加入裂解液直至淹没新咽拭子头，温育裂解； y44）将温育后的EP管置于离心机进行离心分离，取出咽拭子头，保留上清液，即获得蛋白样本。 3.根据权利要求2所述的呼吸道病原体检测方法，其特征在于，所述裂解液为AG4；针对痰液样本，裂解液与痰液的体积比为1:1。 4.根据权利要求2所述的呼吸道病原体检测方法，其特征在于，还包括对抗体芯片的验证，对抗体芯片验证的方法为： k1）对温育裂解后所获得的液体进行稀释； k2）将稀释后的液体制备到第一多孔板中； k3）将第一多孔板中的液体进一步制备到第二多孔板中，使第一多孔板中每一第一微孔适配于第二多孔板中的多个第二微孔，而在相应的多个第二微孔中制备出适配于第一微孔内液体的梯度稀释液体； k4）将梯度稀释液体制备到PWG芯片上，然后进行芯片封闭； k5）对芯片封闭后的PWG芯片进行温育； k6）对温育后的PWG芯片进行洗涤，然后进行信号读取。 5.根据权利要求4所述的呼吸道病原体检测方法，其特征在于，步骤k1）中稀释所获得的液体的浓度为0.1~0.2微克/微升。 6.根据权利要求4或5所述的呼吸道病原体检测方法，其特征在于，每一第一微孔与四个第二微孔对应，相对应于的梯度稀释液体的四个梯度为：100%、75%、50%、25%。 7.根据权利要求4所述的呼吸道病原体检测方法，其特征在于，PWG芯片上的芯片单元具有多个小单元，每个小单元适配一种抗体。 8.根据权利要求4或7所述的呼吸道病原体检测方法，其特征在于，制备PWG芯片的方法是通过微量点阵仪将梯度稀释液体制备到PWG芯片上，在PWG芯片的制备过程中，应保持50%的湿度以及16摄氏度的温度。 9.根据权利要求4所述的呼吸道病原体检测方法，其特征在于，步骤k5）在进行温育前，对芯片封闭后的PWG芯片进行浸泡洗涤，洗涤次数不少与3次，且不多于5次；其中，芯片封闭的时间不少于25分钟，且不多于35分钟。 10.根据权利要求4所述的呼吸道病原体检测方法，其特征在于，步骤k5）中，温育温度为37摄氏度，针对一抗温育时间为30分钟，针对二抗温育时间为30分钟。 11.根据权利要求4所述的呼吸道病原体检测方法，其特征在于，步骤k4）所适配抗体的稀释度为1:2500。 12.根据权利要求1所述的呼吸道病原体检测方法，其特征在于，在步骤2）前，还包括对步骤1）提取到的蛋白样本进行抗体适应性筛选的步骤。 13.根据权利要求12所述的呼吸道病原体检测方法，其特征在于，抗体适应性筛选的方法为蛋白免疫印迹法。
所属类别：	发明专利