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原文传递一种毒死蜱单克隆抗体及其制备方法与应用

专利名称：	一种毒死蜱单克隆抗体及其制备方法与应用
摘要：	本发明涉及一种毒死蜱单克隆抗体及其制备方法与应用，本发明的有益效果为特异性强，敏感性高，简便快速，结果显示形象、直观、准确；节省费用，适用范围广，便于推广；制得的毒死蜱胶体金试纸条，无需专业操作人员及任何辅助类仪器，根据反应所显现的条带几分钟内即可判定结果，不仅操作简便、快速、结果直观准确、成本低，并且可以在室外进行检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	苏州快捷康生物技术有限公司
发明人：	盛相国
专利状态：	有效
申请日期：	2018-12-25T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-28T00:00:00+0800
申请号：	CN201811589540.2
公开号：	CN109946454A
代理机构：	北京轻创知识产权代理有限公司
代理人：	谈杰
分类号：	G01N33/559(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	215128 江苏省苏州市吴中经济开发区田上江路105号15幢302室
主权项：	1.一种毒死蜱单克隆抗体，其特征在于：其抗体重链可变区氨基酸序列为： QVKLQQSGPGLVAPSQSLKTSICTVSGSLFPGLRGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWSGRTNYHSALISRLSISKDNSKSQVFLKLNSLQIDDSATYYCAQRREVRWGSVDMDYWGQGTSVTVSS；轻链可变区氨基酸序列为： DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINRYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDFSLTISSLEYEDLGIYYCLQYEEFPYTFGGGTKLEIKR。 2.一种毒死蜱单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤(1)：毒死蜱半抗原的合成；步骤(2)：毒死蜱半抗原与载体蛋白偶联；步骤(3)：抗毒死蜱单克隆抗体的制备；步骤(4)：抗体可变区氨基酸序列的测定。 3.根据权利要求2所述的一种毒死蜱单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中毒死蜱半抗原与载体蛋白偶联的载体蛋白是利用活泼酯法将3,5,6-三氯-2-吡啶氧乙酸与牛血清白蛋白(BSA)偶联的产物。 4.根据权利要求2所述的一种毒死蜱单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)包括以下步骤：将步骤(3)中所制得的毒死蜱单克隆抗体免疫小鼠；无菌条件下取出小鼠脾细胞，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合与培养，培养至细胞长满培养孔1/3～1/2时进行亚克隆，然后扩大培养，建立杂交瘤细胞株；使用特异性的细胞株制备腹水并用Protein A进行抗体纯化，之后去盐并冷冻抽干获得干粉状抗体，冻存备用。 5.根据权利要求4所述的一种毒死蜱单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述小鼠为6～8周龄健康的雌性BALB/c小鼠，毒死蜱单克隆抗体免疫健康的雌性BALB/c小鼠的每次间隔时间为2～3周，最后一次超强免疫后3天。 6.根据权利要求4所述的一种毒死蜱单克隆抗体的制备方法，其特征在于：小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0以10：1的细胞数量用PEG介导的方法融合，融合后置于37℃、5％CO2培养箱中培养，所述亚克隆次数大于或等于3，且每次亚克隆均采用间接竞争ELISA法选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行亚克隆。 7.根据权利要求4所述的一种毒死蜱单克隆抗体的制备方法，其特征在于：冻存的温度为-20℃。 8.根据权利要求2所述的一种毒死蜱单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述毒死蜱半抗原的合成包括以下步骤：步骤a：O-乙基-O-(3，5，6三吡啶基)硫代磷酰氯的合成：将O-乙基硫代磷酰氯和K2CO3溶于乙腈中制得混合溶液，将3,5,6-三氯-2-羟基吡啶溶液于常温下逐滴加入所述混合溶液中，反应1h，获得反应液，将反应液真空过滤，蒸去溶剂，得到C1；对C1进行柱层析，用石油醚/二氯甲烷洗涤，蒸去溶剂得淡黄色油状液体；步骤b:O-乙基-O-(3，5，6三氯吡啶基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯的合成:称取4-氨基丁酸与KOH溶解于甲醇中，冰水浴冷却至0-10℃，搅拌下缓慢加入溶解于甲醇溶液的O-乙基-O-(3，5，6三吡啶基)硫代磷酰氯，保温反应2h；反应完毕后，用石油醚/乙醚洗涤，水层调pH＝3.0后用乙醚提取，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂，得浅黄色油状物。 9.根据权利要求8所述的一种毒死蜱单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤a中石油醚/二氯甲烷的体积比为8:1，所述步骤b中石油醚/乙醚的体积比为7:1。 10.一种毒死蜱单克隆抗体的应用，其特征在于：包括以下步骤： 1)毒死蜱金标抗体的制备； 2)金标结合物垫的制备； 3)毒死蜱半抗原偶联的载体蛋白溶液和兔抗鼠IgG抗体包被纤维素膜； 4)毒死蜱胶体金试纸条。
所属类别：	发明专利