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原文传递一种用于检测C-反应蛋白的荧光探针及其制备方法

专利名称：	一种用于检测C-反应蛋白的荧光探针及其制备方法
摘要：	本发明提供了一种用于检测C‑反应蛋白的荧光探针及其制备方法。该技术方案先采用噬菌体展示技术筛选出与其特异结合的重组噬菌体，通过提取重组噬菌体的ssDNA进行测序及序列比对，获得一条CRP特异性亲和配体序列。在此基础上，本发明基于固相多肽合成技术合成该配体，并对其进行荧光标记，从而获得与CRP特异性结合的荧光探针。用待测血清样本包被荧光酶标板，加入一定浓度荧光探针，该探针可与CRP特异性结合，随后用适宜的缓冲液洗去未结合的荧光探针，用荧光酶标仪检测其荧光强度，此时的荧光强度严格受到待测样本中CRP含量的控制。本发明为CRP的特异性识别、含量检测提供了一种全新的工具。该荧光探针既可以定性地鉴别CRP，也可以用于定量检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	吉林;22
申请人：	长春理工大学
发明人：	张淑华;刘娜;王晴;罗杰;张馨予;李颂
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-13T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-28T00:00:00+0800
申请号：	CN201910188381.3
公开号：	CN109946273A
代理机构：	北京汇捷知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	李宏伟
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	130000 吉林省长春市卫星路7089号
主权项：	1.一种C-反应蛋白的特异性亲和配体，其特征在于该配体的氨基酸序列为：S-P-H-N-R-S-N-L-V-Q-E-L。 2.一种权利要求1所述的特异性亲和配体的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1)将CRP进行包被，包被过夜后弃去包被液加封阻液封闭，而后弃去封阻液利用TBST缓冲液冲洗，而后与噬菌体混合孵育，再将与CRP特异性结合的噬菌体洗脱； 2)重复步骤1)若干次；每次中用于混合孵育的噬菌体均为前次被洗脱后扩增至数量为2×1011pfu的、与CRP特异性结合的噬菌体； 3)针对步骤2)最后一次所获得的与CRP特异性结合的噬菌体，进行滴度测定，从噬菌斑数量为30～300个的滴度测定平板上随机挑取蓝斑，提取ssDNA后测序。 3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤1)中所述将CRP进行包被，包括以下步骤：将CRP用0.1mol/L、pH8.6的NaHCO3溶液配制成100μg/mL的溶液，而后取1mL该溶液进行包被。 4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤1)中所述的混合孵育包括以下步骤：向冲洗后的CRP包被平皿加入1mL的TBST溶液，再加入2×1011的噬菌体，于室温下摇动1h。 5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤1)中所述将与CRP特异性结合的噬菌体洗脱，包括以下步骤：混合孵育完毕后，弃去液相，用TBST缓冲液冲洗容器10次，而后加入1mL含有1mg/mL BSA的、浓度为0.2mol/L的Glycine-HCl，在室温下摇动1h，而后吸除液相，再向其中加入150μL浓度为1mol/L的Tris-HCl中和，中和产物即为所述与CRP特异性结合的噬菌体。 6.一种用于检测C-反应蛋白的荧光探针，其特征在于该荧光探针的分子结构为：FITC-Acp-S-P-H-N-R-S-N-L-V-Q-E-L；其中，Acp为6-氨基己酸，FITC为异硫氰酸荧光素。 7.一种权利要求6所述的荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1)将取代度为1.03mmoL/g的2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂用DCM溶液浸泡0.5h使其溶胀，通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-Pr-OH氨基酸，加入DMF溶液进行溶解，然后添加10倍摩尔过量的DIEA，充分震荡1h，采用DMF和DCM交替淋洗6次，而后用甲醇进行封闭； 2)弃去DMF，添加20％哌啶DMF溶液至15ml/g，振荡5min，去除DMF，再添加20％哌啶DMF溶液至15ml/g，振荡15min；弃去哌啶DFM溶液，取树脂颗粒，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105～110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应；依次使用10mL/g的DMF洗两次，10mL/g的DCM洗两次，10mL/g的DMF洗两次；将保护氨基酸3倍过量，HBTU 3倍过量均用DMF溶解，加入到反应管中，立刻加入DIEA 10倍过量，反应30min；依次使用10mL/g的DMF洗一次，10mL/g的DCM洗两次，10mL/g的DMF洗两次； 3)重复步骤2)，按S-P-H-N-R-S-N-L-V-Q-E-L的序列从右至左依次连接氨基酸，而后连接Fmoc-Acp-OH，再标记5-FITC，避光反应4h； 4)从树脂上分离纯化所述荧光探针。 8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述检测试剂为：茚三酮、KCN、苯酚溶液各一滴。 9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于步骤3)中所述标记5-FITC包括以下步骤：在避光的条件下，将合成氨基酸肽链的N端与6-氨基己酸(6-Acp)的C端相连，N端连接FITC荧光素，即完成了FITC的标记。 10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于步骤4)包括以下操作：在避光条件下，对树脂依次使用10mL/g的DMF洗两次，10mL/g的甲醇洗两次，10mL/g的DMF洗两次，10mL/g的DCM洗两次，真空抽干10min，干燥过夜；向树脂中加入切割液，切割时间为120min；将切割液用氮气吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干，即得到荧光探针粗品；将所述荧光探针粗品进行HPLC分离；所述HPLC分离的色谱条件为：柱温35℃；检测波长220nm；流动相A为含有0.1％TFA的水溶液；流动相B为含有0.1％的乙腈溶液；梯度洗脱为25％乙腈～45％流动相B溶液。
所属类别：	发明专利