详情

原文传递一种用于检测猪伪狂犬病病毒gE抗体的包被抗原和酶标抗体及阻断法试剂盒

专利名称：	一种用于检测猪伪狂犬病病毒gE抗体的包被抗原和酶标抗体及阻断法试剂盒
摘要：	本发明涉及一种用于检测猪伪狂犬病病毒gE抗体的阻断法试剂盒，该试剂盒中含有包被了本发明的猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原的支持介质或包被猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原和猪伪狂犬病病毒经典株全病毒灭活抗原两种抗原的支持介质、酶标记的单克隆抗体11H1、以及用于对猪伪狂犬病病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。本发明的试剂盒能广谱性地检测感染了猪伪狂犬病病毒的猪血清中的gE抗体，检测灵敏度高，特异性好，检测后的灰区即可疑样品少，易于伪狂犬病的净化。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	河南;41
申请人：	洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司
发明人：	田克恭;晋育丹;昌静峰
专利状态：	有效
申请日期：	2017-12-25T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-02T00:00:00+0800
申请号：	CN201711420798.5
公开号：	CN109959788A
代理机构：	北京华夏正合知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	韩登营
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	471003 河南省洛阳市高新区华夏路
主权项：	1.一种用于检测猪伪狂犬病病毒gE抗体的阻断法试剂盒，其中，所述试剂盒包括：包被了猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原的支持介质或包被猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原和猪伪狂犬病病毒经典株全病毒灭活抗原两种抗原的支持介质、酶标记的单克隆抗体11H1、以及用于对猪伪狂犬病病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照；其中所述猪伪狂犬病病毒变异株为HN1201株、HN1202株、JS-2012株、HeN1株、NVDC-PRV-BJ株、NVDC-PRV-HEB株、NVDC-PRV-SD株、TJ株、或ZJ01株，所述猪伪狂犬病病毒经典株为Fa株或Ma株；所述单克隆抗体11H1抗体的可变区序列由重链可变区和轻链可变区组成，所述重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体，所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ IDNo.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原和猪伪狂犬病病毒经典株全病毒灭活抗原的制备先用二乙烯亚胺灭活，再用膜包切向流进行浓缩，最后经差速离心纯化获得抗原，或者先用β-丙内酯灭活，再用PEG20000进行浓缩，最后经密度梯度离心纯化获得抗原。 2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述支持介质仅包被猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原时，所述猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原的制备先用二乙烯亚胺灭活，再用膜包切向流进行浓缩，最后经差速离心纯化获得抗原；所述支持介质包被猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原和猪伪狂犬病病毒经典株全病毒灭活抗原两种抗原时，所述猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原的制备先用二乙烯亚胺灭活，再用膜包切向流进行浓缩，最后经差速离心纯化获得抗原，所述猪伪狂犬病病毒经典株全病毒灭活抗原的制备先用β-丙内酯灭活，再用PEG20000进行浓缩，最后经密度梯度离心纯化获得抗原。 3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述二乙烯亚胺灭活是用浓度14mM～70mM的BEA环化处理2小时，后于25～37℃摇床于转速50～200r/min灭活12～24小时，之后用硫代硫酸钠处理2～8小时；所述β-丙内酯灭活是用浓度0.01％～0.05％(w/t)的BPL灭活8～16小时；所述PEG20000透析浓缩是将PRV病毒液装入孔径500kDa以内的透析袋中，两端固定或夹住，在透析袋上下表面铺上PEG20000固体，放入2～8℃冰箱进行浓缩，浓缩20～50倍；所述膜包切向流超滤浓缩是采用500kDa以内的膜包进行切向流超滤浓缩，浓缩20～50倍；所述差速离心纯化将浓缩后的病毒液于转速35000r/min离心1～3小时，沉淀用1/10体积的0.02mol/L，pH值为7.4的PBS溶液吹溶，在转速5000r/min离心5～20分钟取上清；所述密度梯度离心纯化方法，采用30％～50％蔗糖介质密度梯度层、50％酒石酸钾-5％甘油～10％酒石酸钾-25％甘油、和5％～8％Nycodenz密度梯度层按转速35000r/min离心2～5小时。 4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述包被抗原浓度为0.5～5.0μg/ml，所述酶标记的单克隆抗体11H1标记前浓度为2～8mg/ml、IFA效价为1∶1600～1∶6400；优选地，所述包被抗原浓度为1.0μg/ml。 5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述支持介质优选为微滴定板；所述标记的酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、或β-D-半乳糖甘酶；所述对猪伪狂犬病病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂为显色剂A液、B液，显色剂A液为每1L水中含磷酸氢二钠14.7g、柠檬酸9.3g、过氧化脲0.3g，显色剂B液为每1L水中含四甲基联苯二胺0.2g、无水乙醇100ml；所述阳性对照免疫猪伪狂犬病病毒变异株或猪伪狂犬病病毒经典株后攻毒的猪只血清，所述阴性对照为PRV抗原、抗体阴性的健康易感猪只的血清；所述试剂盒还包括终止液、洗涤液，所述终止液为2M H2SO4溶液，所述洗涤液为PBS溶液。 6.一种单克隆抗体11H1，所述单克隆抗体11H1的可变区序列由重链可变区和轻链可变区组成，所述重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体，所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；优选地，所述单克隆抗体11H1，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。 7.根据权利要求6所述单克隆抗体11H1的可变区序列。 8.一种制备猪伪狂犬病病毒全病毒灭活抗原的方法，其中，所述方法包括先用二乙烯亚胺灭活，再用膜包切向流进行浓缩，最后经差速离心纯化获得抗原，或者先用β-丙内酯灭活，再用PEG20000进行浓缩，最后经密度梯度离心纯化获得抗原；优选地，所述猪伪狂犬病病毒全病毒灭活抗原为猪伪狂犬病病毒经典株或变异株全病毒灭活抗原。 9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述二乙烯亚胺灭活是用浓度14mM～70mM的BEA环化处理2小时，后于25～37℃摇床在转速50～200r/min灭活12～24小时，之后用硫代硫酸钠处理2～8小时；所述β-丙内酯灭活是用浓度0.01％～0.05％(wt)的BPL灭活8～16小时；所述PEG20000透析浓缩是将PRV病毒液装入孔径500kDa以内的透析袋中，两端固定或夹住，在透析袋上下表面铺上PEG20000固体，放入2～8℃冰箱进行浓缩，浓缩20～50倍；所述膜包切向流超滤浓缩是采用500kDa以内的膜包进行切向流超滤浓缩，浓缩20～50倍；所述差速离心纯化将浓缩后的病毒液于转速35000r/min离心1～3小时，沉淀用1/10体积的0.02mol/L，pH值为7.4的PBS溶液吹溶，于转速5000r/min离心5～20分钟取上清；所述密度梯度离心纯化方法，采用30％～50％蔗糖介质密度梯度层、50％酒石酸钾-5％甘油～10％酒石酸钾-25％甘油、和5％～8％Nycodenz密度梯度层按转速35000r/min离心2～5小时。 10.根据权利要求8或9所述方法制备的抗原。
所属类别：	发明专利