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原文传递一种猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用

专利名称：	一种猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用
摘要：	本发明公开了一种猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用。该试剂盒包括酶标板、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标猪伪狂犬病毒单克隆抗体、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、终止液，其中所述酶标板包被有利用杆状病毒表达系统及细胞悬浮培养工艺表达的猪伪狂犬病毒gE蛋白，将其纯化后作为包被抗原，同时用作免疫原，制备并筛选出伪狂犬病毒gE蛋白的特异性单克隆抗体并进行过氧化物酶标记作为阻断酶标单抗。本发明试剂盒敏感性高、特异性好、且操作便捷，结果判定采用S/N比值法，准确度高，与进口试剂盒相比，检测符合率达98％以上。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	中牧实业股份有限公司
发明人：	董春娜;张蕾;李静;李玲;王飞;肖进;齐鹏
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-29T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-18T00:00:00+0800
申请号：	CN201910249606.1
公开号：	CN109900903A
代理机构：	北京惟诚致远知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	王慧凤;李巍
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	100070 北京市丰台区南四环西路188号八区16-19号楼
主权项：	1.一种猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒，包括酶联反应板和酶标抗体，其中所述酶联反应板包被有猪伪狂犬病毒gE蛋白，酶标二抗为用辣根过氧化物酶标记的抗猪伪狂犬病毒gE蛋白的单克隆抗体。 2.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述猪伪狂犬病毒gE蛋白为利用杆状病毒表达系统以及昆虫细胞悬浮培养工艺表达获得；所述猪伪狂犬病毒gE蛋白的序列为序列表中序列6。 3.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述抗猪伪狂犬病毒gE蛋白的单克隆抗体，含有重链可变区(PRV-Mc2-VH)和轻链可变区(PRV-Mc2-VL)；所述PRV-Mc2-VH和PRV-Mc2-VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述PRV-Mc2-VH和所述PRV-Mc2-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述PRV-Mc2-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第25～34位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第52～59位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第94～108位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第24～35位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第50～59位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第94～100位氨基酸所示。 4.根据权利要求3所述的猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述PRV-Mc2-VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1～123位所示；其PRV-Mc2-VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1～117位所示。 5.根据权利要求1-4中任意一项所述的猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板的获得方法是将所述猪伪狂犬病毒gE蛋白溶于100μl的pH9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔0.1μg～1μg猪伪狂犬病毒gE蛋白，2～8℃下放置8～12小时，使包被抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。 6.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括底物液A、底物液B和终止液；所述底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。 7.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括样品稀释液和20倍浓缩洗涤液；样品稀释液为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；浓缩洗涤液为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；和/或，所述阳性对照血清为猪伪狂犬病毒人工感染后采集的猪血清；所述阴性对照血清为无猪伪狂犬病毒病原体感染且无疫苗接种的猪血清。 8.权利要求1～7所述的猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒在制备检测猪伪狂犬病毒感染或疫苗接种的待测样品的试剂中的应用；待测样品为感染野毒株或应用过非gE基因缺失病毒疫苗的猪只血清。 9.一株单克隆抗体，其可与猪伪狂犬病毒gE蛋白特异性结合，是下述任意一项所述的单克隆抗体： 1)含有重链可变区(PRV-Mc2-VH)和轻链可变区(PRV-Mc2-VL)；所述PRV-Mc2-VH和PRV-Mc2-VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述PRV-Mc2-VH和所述PRV-Mc2-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述PRV-Mc2-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第25～34位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第52～59位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第94～108位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第24～35位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第50～59位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第94～100位氨基酸所示。 2)含有重链可变区PRV-Mc2-VH和轻链可变区PRV-Mc2-VL；所述PRV-Mc2-VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1～123位所示；其PRV-Mc2-VL的氨基酸序列如序列表中SEQID No.2的第1～117位所示。 10.权利要求9所述的单克隆抗体在制备检测伪狂犬病毒gE抗体的试剂盒中的应用。
所属类别：	发明专利