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原文传递一种猪瘟抗体阻断检测试纸

专利名称：	一种猪瘟抗体阻断检测试纸
摘要：	本发明公开了一种猪瘟抗体阻断检测试纸，由支撑板、抗原垫、金标垫、检测膜和吸水垫构成，抗原垫吸附猪瘟病毒检测抗原，金标垫吸附胶体金标记的抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb1，检测膜上含有检测线T“\|”和质控线C“\|”印迹，检测线T为抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb2或抗猪瘟病毒多克隆抗体pAb1印迹，质控线C为抗小鼠IgG抗体pAb2或金黄色葡萄球菌SPA印迹。本发明试纸实现了猪瘟病毒中和抗体的快速检测，可实现对猪瘟母源抗体和免疫抗体水平的实时监测，以及疫苗免疫效果的免疫评价，并且操作简单，人人都可操作，能较好满足不同层次人员的需要，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	河南;41
申请人：	河南省农业科学院
发明人：	王丽;杨艳艳;李青梅;柴书军;张改平;郭军庆;杨继飞;张雨杭;周人杰;孙亚宁;王瑞宁;许倩茹
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-15T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-26T00:00:00+0800
申请号：	CN201910407980.X
公开号：	CN110058019A
代理机构：	郑州市华翔专利代理事务所(普通合伙)
代理人：	张爱军
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	450000 河南省郑州市金水区花园路116号
主权项：	1.一种猪瘟抗体阻断检测试纸，由支撑板、抗原垫、金标垫、检测膜和吸水垫构成，其特征在于，抗原垫吸附猪瘟病毒检测抗原，金标垫吸附胶体金标记的抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb1，检测膜上含有检测线T“\|”和质控线C“\|”印迹，检测线T为抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb2或抗猪瘟病毒多克隆抗体pAb1印迹，质控线C为抗小鼠IgG抗体pAb2或金黄色葡萄球菌SPA印迹。 2.根据权利要求1所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，所述试纸以单克隆抗体阻断模式检测猪瘟中和抗体，在检测膜显现两条红色条带“\|\|”，且检测线T显色强度与空白对照相当，则为猪瘟抗体阴性；显现两条红色条带“\|\|”，但检测线T明显弱于空白对照，则为猪瘟抗体弱阳性；只显现一条红色条带“\|”，则为猪瘟抗体强阳性。 3.根据权利要求1所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb1具有病毒中和VN活性，特异识别E2蛋白中和抗原表位；单克隆抗体mAb2特异识别E2蛋白非中和抗原表位；猪瘟病毒检测抗原为猪瘟病毒抗原，E2重组蛋白或多肽抗原。 4.根据权利要求3所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb1和mAb2的制备方法为： (1)猪瘟病毒免疫抗原的制备以猪瘟病毒标准强毒株石门株接种猪肾细胞PK-15，48～60h收取病毒培养液，4℃3000r/min低速离心30min去除杂质，利用50kDa超滤膜对病毒培养液进行超滤浓缩，以Sepherose 4 Fast Flow琼脂糖凝胶柱对猪瘟病毒进行凝胶过滤层析纯化，测定猪瘟病毒的半数细胞培养物感染量达10-7以上，荧光定量PCR测定纯化病毒拷贝数达1010以上； (2)抗猪瘟病毒单克隆抗体的制备 (2.1)杂交瘤细胞株的建立将猪瘟病毒免疫抗原免疫小鼠，建立抗猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株； (2.2)单克隆抗体的制备 (2.3)单克隆抗体的鉴定 (2.3.1)单克隆抗体的抗体效价以酶联免疫吸附试验和免疫过氧化物酶单层细胞试验测定杂交瘤细胞培养上清和腹水的单抗效价，单抗上清和腹水的ELISA效价分别在1:400和1:105以上，IPMA效价分别在1:40和1:4000以上； (2.3.2)识别病毒蛋白以Western blot检测单克隆抗体识别猪瘟病毒病毒蛋白； (2.3.3)单克隆抗体亚型鉴定利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒测定猪瘟病毒单克隆抗体的免疫球蛋白亚型； (2.3.4)病毒中和(VN)活性以病毒中和试验测定单克隆抗体腹水对猪瘟病毒的中和活性，筛选获得具有病毒中和活性的单克隆抗体，作为单克隆抗体mAb1，用于胶体金标记； (2.3.5)单克隆抗体识别抗原表位分析以叠加ELISA对CSFV单克隆抗体识别的抗原表位进行分析鉴定，以与单克隆抗体mAb1识别不同抗原表位的单克隆抗体，作为单克隆抗体mAb2，用于检测线T印迹； (2.4)单克隆抗体的纯化以辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化单抗IgG。 5.根据权利要求3所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，猪瘟病毒抗原为经甲醛或β-丙内酯BPL灭活的猪瘟病毒培养物。 6.根据权利要求5所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，猪瘟病毒抗原的具体制备方法为：以猪瘟病毒疫苗毒株HCLV接种猪睾丸细胞ST，48-60h收取病毒培养液，4℃3000r/min低速离心30min去除杂质，利用50kDa超滤膜对病毒培养液进行超滤浓缩，以Sepherose 4 Fast Flow琼脂糖凝胶柱对猪瘟病毒进行凝胶过滤层析纯化，测定猪瘟病毒的半数细胞培养物感染量TCID50达10-7以上；分别在CSFV培养物中加入终浓度为0.1％～0.5％的甲醛溶液或0.02％～0.2％的β-丙内酯，充分混匀，分别置4℃灭活48h或37℃灭活9h，制备CSFV灭活病毒抗原。 7.根据权利要求3所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，重组抗原为利用大肠杆菌或转基因水稻表达纯化的E2重组蛋白。 8.根据权利要求7所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，重组抗原的具体制备方法为： (1)大肠杆菌表达E2蛋白根据CSFV兔化弱毒C株全基因序列合成经大肠杆菌密码子优化的E2基因，并亚克隆入大肠杆菌表达载体pET-32a构建重组表达质粒，将重组质粒pET32a-E2转化大肠杆菌RosettaTM(DE3)，以1mmol/L IPTG诱导表达E2重组蛋白，表达蛋白经8mol/L尿素变性溶解后经Ni-NTA亲和层析纯化和复性，获得纯度90％的E2表达蛋白，以E2抗原检测试纸测定其抗原活性，制备E2蛋白重组抗原； (2)转基因水稻表达E2蛋白根据CSFV流行毒株E2基因序列合成经水稻密码子优化的E2基因，并相继亚克隆入中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA1300，构建转基因水稻重组表达质粒，通过农杆菌介导水稻遗传转化，筛选获得E2转基因水稻纯合子株系，E2抗原检测试纸检测表明E2蛋白在水稻胚乳中高效表达；以镍亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析对转基因水稻表达蛋白进行纯化，获得纯度95％的E2表达蛋白，以E2抗原检测试纸测定其抗原活性，制备E2蛋白重组抗原。 9.根据权利要求3所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，多肽抗原为抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb1和mAb2抗原表位多肽与载体蛋白偶联的人工抗原；具体制备方法为：利用多肽合成仪以固相多肽合成方法合成单克隆抗体mAb1和mAb2抗原表位多肽，在多肽N端均加入Cys，用于载体蛋白偶联；将mAb1和mAb2的抗原表位多肽按摩尔比4:1、2:1、1:1、1:2和1:4混合，利用异型双功能试剂SMCC将多肽与牛血清白蛋白、免疫球蛋白、卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白按不同摩尔比进行偶联，获得不同多肽混合比的多肽偶联抗原，以Dot-Blot或猪瘟病毒抗原检测试纸测定E2偶联多肽抗原活性，并测定抗猪瘟病毒血清对胶体金标记抗体的阻断效率，获得最佳多肽配比和多肽/载体蛋白的偶联多肽抗原，制备E2蛋白多肽抗原。 10.根据权利要求1所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，抗原垫的制备方法为：将玻璃纤维棉切成条状，以含0.1mol/L NaCl、0.2％Tween20(v/v)和0.1％(w/v)叠氮钠的PBS(pH7.2)溶液分别将猪瘟病毒抗原、E2重组蛋白和多肽抗原做系列稀释，并以15μL/cm将猪瘟病毒检测抗原喷点于玻璃棉，干燥；将抗原垫置于塑料袋，加干燥剂室温密闭保存备用；利用吸附不同检测抗原的抗原垫装配试纸，以不同浓度抗猪瘟病毒阳性血清测定试纸阻断效果，通过对不同抗原及其浓度的组合筛选，获得抗原垫的最佳工作浓度为：病毒抗原100μg/mL，重组蛋白200μg/mL，多肽抗原100μg/mL。
所属类别：	发明专利