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原文传递一种伪狂犬病抗体阻断检测试纸

专利名称：	一种伪狂犬病抗体阻断检测试纸
摘要：	本发明公开了一种伪狂犬病抗体阻断检测试纸，由支撑板、抗原垫、金标垫、检测膜和吸水垫构成，抗原垫吸附伪狂犬病病毒检测抗原，金标垫吸附胶体金标记的抗伪狂犬病病毒gE和gB单克隆抗体mAb1和mAb2，检测膜上含有强毒检测线T1“\|”、疫苗毒检测线T2“\|”和质控线C“\|”印迹，强毒检测线T1为抗伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体mAb3印迹，疫苗毒检测线T2为抗伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体mAb4印迹，质控线C为兔抗小鼠IgG抗体pAb1或金黄色葡萄球菌SPA印迹“\|”。该试纸实现了伪狂犬病病毒感染和免疫抗体的快速检测和实时监测，感染与免疫鉴别检测以及疫苗免疫效果的免疫评价，并且操作简单，易于大范围推广应用。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	河南;41
申请人：	河南百奥生物工程有限公司
发明人：	张改平;杨继飞;王栋;李艳华;郭军庆;李青梅;刘亚伟;张晓晨
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-15T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-30T00:00:00+0800
申请号：	CN201910403540.7
公开号：	CN110068686A
代理机构：	郑州市华翔专利代理事务所(普通合伙)
代理人：	张爱军
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	450000 河南省郑州市高新技术产业开发区冬青街22号
主权项：	1.一种伪狂犬病抗体阻断检测试纸，由支撑板、抗原垫、金标垫、检测膜和吸水垫构成，其特征在于，抗原垫吸附伪狂犬病病毒检测抗原，金标垫吸附胶体金标记的抗伪狂犬病病毒gE和gB单克隆抗体mAb1和mAb2，检测膜上含有强毒检测线T1“\|”、疫苗毒检测线T2“\|”和质控线C“\|”印迹，强毒检测线T1为抗伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体mAb3印迹，疫苗毒检测线T2为抗伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体mAb4印迹，质控线C为兔抗小鼠IgG抗体pAb1或金黄色葡萄球菌SPA印迹“\|”。 2.根据权利要求1所述的伪狂犬病抗体阻断检测试纸，其特征在于，所述试纸以单克降抗体阻断模式检测伪狂犬病感染和免疫抗体，在检测膜显现三条红色条带“\|\|\|”，且检测线T1和T2显色强度与空白对照相当，为伪狂犬病抗体阴性；显现三条红色条带“\|\|\|”，但检测线T1和T2显色强度明显弱于空白对照，为伪狂犬病感染抗体弱阳性；仅显现一条红色条带“\|”，为伪狂犬病感染抗体强阳性；显现三条红色条带“\|\|\|”，且检测线T2显色强度明显弱于空白对照，为伪狂犬病免疫抗体弱阳性；显现两条红色条带“\|\|”，为伪狂犬病疫苗免疫抗体强阳性。 3.根据权利要求1所述的伪狂犬病抗体阻断检测试纸，其特征在于，单克隆抗体mAb1和mAb3特异识别伪狂犬病病毒强毒株，但不与疫苗毒株反应，分别识别伪狂犬病病毒gE蛋白的不同抗原表位；单克隆抗体mAb2和mAb4特异识别伪狂犬病病毒强毒株和疫苗毒株，分别识别伪狂犬病病毒gB蛋白的不同抗原表位。 4.根据权利要求1所述的伪狂犬病抗体阻断检测试纸，其特征在于，单克隆抗体mAb1和mAb3、mAb2和mAb4的制备方法为： (1)伪狂犬病病毒免疫抗原的制备 (1.1)伪狂犬病病毒gE重组蛋白的制备以PCR扩增PRV gE蛋白的表位富集区，将目的基因克隆入原核表达载体pET-28a，构建gE基因重组表达质粒pET-gE，经0.4mol/LIPTG诱导，在大肠杆菌中高效表达gE重组蛋白，Western blot检测表明gE表达蛋白均能被PRV强毒阳性血清特异识别，采用Ni柱亲和层析纯化技术获得纯化的gE重组蛋白； (1.2)伪狂犬病病毒gB重组蛋白的制备以PCR扩增PRV gB蛋白的中和表位富集区，将目的基因克隆入原核表达载体pET-28a，构建gB基因重组表达质粒pET-gB，经1mol/L IPTG诱导，在大肠杆菌中高效表达gB重组蛋白，Western blot检测表明gB表达蛋白均能被PRV阳性血清特异识别，采用Ni柱亲和层析纯化及稀释复性技术获得纯化的gB重组蛋白； (2)抗伪狂犬病病毒单克隆抗体的制备 (2.1)杂交瘤细胞株的建立以伪狂犬病病毒gE和gB重组蛋白为免疫抗原，免疫小鼠，分别建立抗伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株和gB蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株； (2.2)单克隆抗体的制备 (2.3)单克隆抗体的鉴定 (2.3.1)单克隆抗体的抗体效价以酶联免疫吸附试验和免疫过氧化物酶单层细胞试验测定杂交瘤细胞培养上清和腹水的单抗效价； (2.3.2)单克隆抗体的特异性用PRV标准毒株、流行毒株和疫苗毒株感染仓鼠肾细胞BHK-21，以免疫过氧化物酶单层细胞试验测定gE和gB单抗与PRV流行毒株和疫苗株的反应性； (2.3.3)单克隆抗体亚型鉴定利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒分别测定gE和gB蛋白单克隆抗体的免疫球蛋白亚型； (2.3.4)单克隆抗体识别抗原表位分析以叠加ELISA对PRV单克隆抗体识别的抗原表位进行分析鉴定，gE单克隆抗体叠加ELISA结果显示，两个单抗的AI值小于40％，识别gE蛋白相同或相近抗原表位，作为单克隆抗体mAb1用于胶体金标记；若两个单抗的AI值大于40％，识别gE蛋白不同抗原表位，作为单克隆抗体mAb3用于强毒检测线T1印迹；gB单克隆抗体叠加ELISA结果显示，两个单抗的AI值小于40％，识别gB蛋白相同或相近抗原表位，作为单克隆抗体mAb2用于胶体金标记抗体；若两个单抗的AI值大于40％，且二者之间AI值大于40％，分别识别gB蛋白不同的抗原表位，作为单克隆抗体mAb4用于疫苗毒检测线T2印迹； (2.4)单克隆抗体的纯化以辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化单抗IgG。 5.根据权利要求1所述的伪狂犬病抗体阻断检测试纸，其特征在于，伪狂犬病病毒检测抗原为伪狂犬病病毒抗原、gE和gB蛋白重组抗原。 6.根据权利要求5所述的伪狂犬病抗体阻断检测试纸，其特征在于，伪狂犬病病毒抗原为经甲醛或β-丙内酯BPL灭活的伪狂犬病病毒浓缩液。 7.根据权利要求6所述的伪狂犬病抗体阻断检测试纸，其特征在于，伪狂犬病病毒抗原的具体制备方法为：以伪狂犬病病毒汤阴株感染BHK-21细胞，48h后将病变细胞与-80℃和37℃反复冻融3次，4℃10000r/min离心30min，取上清，测病毒TCID50达到10-6/0.1mL以上；在PRV病毒液中加入终浓度0.1％～0.5％甲醛溶液充分混匀，置37℃灭活48h，制备PRV灭活病毒抗原。 8.根据权利要求5所述的伪狂犬病抗体阻断检测试纸，其特征在于，gE和gB蛋白重组抗原为利用大肠杆菌表达纯化的gE和gB重组蛋白。 9.根据权利要求5所述的伪狂犬病抗体阻断检测试纸，其特征在于，抗原垫的制备方法如下：将玻璃纤维棉按规格切成条状，以含0.1mol/L NaCl、0.2％Tween 20(v/v)和0.1％(w/v)叠氮钠的PBS(pH7.2)溶液，分别将PRV病毒抗原做系列稀释，并以15μL/cm的用量将PRV检测抗原喷点于玻璃棉，干燥；将抗原垫置塑料袋，加干燥剂室温密闭保存备用；利用吸附检测抗原的抗原垫装配试纸，以不同浓度猪抗PRV阳性血清测定试纸阻断效果，通过对抗原不同浓度的筛选，获得抗原垫的最佳工作浓度为：病毒抗原为100μg/mL，重组抗原为200μg/mL。
所属类别：	发明专利