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原文传递一种新城疫抗体阻断检测试纸

专利名称：	一种新城疫抗体阻断检测试纸
摘要：	本发明公开了一种新城疫抗体阻断检测试纸，由支撑板、抗原垫、金标垫、检测膜和吸水垫构成，抗原垫吸附新城疫病毒检测抗原，金标垫吸附胶体金标记的抗新城疫病毒单克隆抗体mAb1，检测膜上含有检测线T“\|”和质控线C“\|”印迹，检测线T为抗新城疫病毒单克隆抗体mAb2或抗新城疫病毒多克隆抗体pAb1印迹“\|”，质控线C为兔抗小鼠IgG抗体pAb2或金黄色葡萄球菌SPA印迹“\|”。本发明试纸实现了新城疫病毒中和抗体的快速检测，可实现对新城疫母源抗体和免疫抗体水平的实时监测，以及疫苗免疫效果的免疫评价，并且操作简单，人人都可操作，能较好满足不同层次人员的需要，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	河南;41
申请人：	河南省农业科学院
发明人：	张改平;邢广旭;张二芹;罗俊;李青梅;郭军庆;王丽;孙亚宁;刘金玲;马凡舒;杨继飞;柴书军
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-15T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-16T00:00:00+0800
申请号：	CN201910403535.6
公开号：	CN110018304A
代理机构：	郑州市华翔专利代理事务所(普通合伙)
代理人：	张爱军
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	450000 河南省郑州市金水区花园路116号
主权项：	1.一种新城疫抗体阻断检测试纸，由支撑板、抗原垫、金标垫、检测膜和吸水垫构成，其特征在于，抗原垫吸附新城疫病毒检测抗原，金标垫吸附胶体金标记的抗新城疫病毒单克隆抗体mAb1，检测膜上含有检测线T“\|”和质控线C“\|”印迹，检测线T为抗新城疫病毒单克隆抗体mAb2或抗新城疫病毒多克隆抗体pAb1印迹“\|”，质控线C为兔抗小鼠IgG抗体pAb2或金黄色葡萄球菌SPA印迹“\|”。 2.根据权利要求1所述的新城疫抗体阻断检测试纸，其特征在于，抗新城疫病毒单克隆抗体mAb1具有血凝抑制HI和病毒中和VN活性，特异识别HN蛋白中和抗原表位；单克隆抗体mAb2具有血凝抑制HI活性，特异识别HN蛋白非中和抗原表位；新城疫病毒检测抗原为病毒抗原，HN蛋白重组抗原或多肽抗原。 3.根据权利要求1所述的新城疫抗体阻断检测试纸，其特征在于，所述试纸是以单克隆抗体阻断模式检测新城疫病毒中和抗体，当检测膜显现两条红色条带“\|\|”，且检测线T显色强度与空白对照相当，为新城疫病毒抗体阴性；显现两条红色条带“\|\|”，但检测线T明显弱于空白对照，为新城疫病毒抗体弱阳性；只显现一条红色条带“\|”，为新城疫病毒抗体强阳性。 4.根据权利要求1所述的新城疫抗体阻断检测试纸，其特征在于，所述抗新城疫病毒单克隆抗体mAb1和mAb2的制备方法为： (1)新城疫病毒免疫抗原的制备以新城疫病毒标准强毒株F48E8经尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，36～48h收取尿囊液，差速离心纯化病毒抗原，4℃3000r/min低速离心30min去除杂质，4℃60000r/min超速离心1h，用7mL 0.01mol/L PBS(pH值7.2)重悬沉淀，以血凝试验测定新城疫病毒的HA效价达2-12以上； (2)抗新城疫病毒单克隆抗体的制备 (2.1)杂交瘤细胞株的建立将新城疫病毒免疫抗原免疫小鼠，建立抗新城疫病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株； (2.2)单克隆抗体的制备 (2.3)单克隆抗体的鉴定 (2.3.1)病毒反应谱用NDV标准毒株、流行毒株和弱毒疫苗株I系、IV系感染鸡胚成纤维细胞或仓鼠肾细胞，以免疫过氧化物酶单层细胞试验测定单克隆抗体阳性克隆与NDV流行毒株的反应性，筛选获得识别NDV标准毒株、流行毒株和弱毒疫苗株的广谱单克隆抗体； (2.3.2)识别病毒蛋白以鸡抗NDV多克隆抗体IgG包被96孔酶标板，转基因水稻表达NDV HN蛋白和F蛋白为检测抗原，以夹心ELISA检测不同株单克隆抗体阳性克隆识别的病毒蛋白，筛选获得特异识别HN蛋白单克隆抗体和特异识别F蛋白的单克隆抗体； (2.3.3)血凝抑制(HI)活性以免疫过氧化物酶单层细胞试验测定单克隆抗体腹水的单抗效价，以血凝抑制试验测定单克隆抗体腹水的HI活性，筛选获得具有血凝抑制活性的单克隆抗体，作为单克隆抗体mAb2，用于检测线T印迹； (2.3.4)病毒中和(VN)活性以病毒中和试验测定单克隆抗体腹水对不同NDV毒株的中和活性，筛选获得具有病毒中和活性单克隆抗体，作为单克隆抗体mAb1，用于胶体金标记； (2.3.5)单克隆抗体亚型鉴定利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒测定抗NDV单克隆抗体的免疫球蛋白亚型； (2.3.6)抗原表位分析利用重叠合成多肽对抗NDV单克隆抗体识别的抗原表位进行分析； (2.4)单克隆抗体的纯化以辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化单抗IgG。 5.根据权利要求2所述的新城疫抗体阻断检测试纸，其特征在于，病毒抗原为经甲醛或β-丙内酯BPL灭活的新城疫病毒尿囊液。 6.根据权利要求5所述的新城疫抗体阻断检测试纸，其特征在于，病毒抗原的具体制备方法为：以新城疫病毒疫苗株LaSota经尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，36～120h收取鸡胚尿囊液，4℃3000r/min低速离心30min，取上清，以血凝试验测定新城疫病毒的HA效价达2-12以上；分别在NDV尿囊液中加入终浓度为0.1％～0.5％的甲醛溶液或0.02％～0.2％的β-丙内酯，充分混匀，分别置4℃灭活48h或37℃灭活9h，制备NDV灭活病毒抗原。 7.根据权利要求2所述的新城疫抗体阻断检测试纸，其特征在于，HN蛋白重组抗原为利用大肠杆菌或转基因水稻表达纯化的HN重组蛋白。 8.根据权利要求7所述的新城疫抗体阻断检测试纸，其特征在于，HN蛋白重组抗原的具体制备方法为： (1)大肠杆菌表达HN蛋白根据NDV流行毒株XX-08 HN基因序列合成经大肠杆菌密码子优化的HN基因，并亚克隆入大肠杆菌表达载体pET-28a构建重组表达质粒，将重组质粒pET28a-rHN转化大肠杆菌BL21(DE3)，以1mmol/L IPTG诱导表达HN重组蛋白，表达蛋白经8mol/L尿素变性溶解后经Ni-NTA亲和层析纯化，获得纯度90％的HN表达蛋白，以NDV抗原检测试纸测定其抗原活性，制备HN蛋白重组抗原； (2)转基因水稻表达HN蛋白根据NDV标准毒株F48E8 HN基因序列，合成经水稻密码子优化的HN基因，并相继亚克隆入中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA1300，构建转基因水稻重组表达质粒，通过农杆菌介导水稻遗传转化，筛选获得HN转基因水稻纯合子株系，NDV抗原检测试纸检测表明HN蛋白在水稻胚乳中高效表达；以镍亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析对转基因水稻表达蛋白进行纯化，获得纯度95％的HN表达蛋白，以NDV抗原检测试纸测定其抗原活性，制备HN蛋白重组抗原。 9.根据权利要求2所述的新城疫抗体阻断检测试纸，其特征在于，多肽抗原为抗新城疫病毒单克隆抗体mAb1和mAb2抗原表位多肽与载体蛋白偶联的人工抗原，载体蛋白为牛血清白蛋白BSA，免疫球蛋白IgG，卵清白蛋白OVA或钥孔血蓝蛋白KLH；具体制备方法为：利用多肽合成仪以固相多肽合成方法合成单克隆抗体mAb1和mAb2抗原表位多肽，在多肽N端均加入Cys，用于载体蛋白偶联；将mAb1和mAb2的抗原表位多肽按摩尔比4:1、2:1、1:1、1:2和1:4混合，利用异型双功能试剂SMCC将多肽与牛血清白蛋白、免疫球蛋白、卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白按不同摩尔比进行偶联，获得不同多肽混合比的多肽偶联抗原，以Dot-Blot或NDV抗原检测试纸测定HN偶联多肽抗原活性，并测定鸡抗NDV血清对胶体金标记抗体的阻断效率，获得最佳多肽配比和多肽/载体蛋白的偶联多肽抗原，制备HN蛋白多肽抗原。 10.根据权利要求1所述的新城疫抗体阻断检测试纸，其特征在于，抗原垫的制备方法为：将玻璃纤维棉切成条状，以含0.1mol/L NaCl、0.2％Tween 20(v/v)和0.1％(w/v)叠氮钠的PBS(pH7.2)溶液分别将NDV病毒抗原、HN重组抗原和多肽抗原做系列稀释，并以15μL/cm将上述NDV检测抗原喷点于玻璃棉，干燥；将抗原垫置塑料袋，加干燥剂室温密闭保存备用；利用吸附不同检测抗原的抗原垫装配试纸，以不同浓度鸡抗NDV阳性血清测定试纸阻断效果，通过对不同抗原及其浓度的组合筛选，获得抗原垫的最佳工作浓度为：病毒抗原4log2 HA单位/100μL，重组抗原200μg/mL，多肽抗原100μg/mL。
所属类别：	发明专利