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原文传递一种动物流感抗体阻断检测试纸

专利名称：	一种动物流感抗体阻断检测试纸
摘要：	本发明公开了一种动物流感抗体阻断检测试纸，由支撑板、抗原垫、金标垫、检测膜和吸水垫构成，抗原垫上吸附流感病毒检测抗原，金标垫吸附胶体金标记的抗流感病毒单克隆抗体mAb1，检测膜上含有检测线T“\|”和质控线C“\|”印迹，检测线T为抗流感病毒单克隆抗体mAb2或抗流感病毒多克隆抗体pAb1印迹，质控线C为抗小鼠IgG兔抗体pAb2或金黄色葡萄球菌SPA印迹。本发明试纸实现了流感病毒中和抗体的快速检测，可实现对动物流感母源抗体和免疫抗体水平的实时监测，以及疫苗免疫效果的免疫评价，并且操作简单，人人都可操作，能较好满足不同层次人员的需要，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	河南;41
申请人：	河南省农业科学院
发明人：	李青梅;柴书军;赵东;张改平;王彦红;郭军庆;刘肖;石建州;李鸽;孙亚宁;杨继飞
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-15T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-26T00:00:00+0800
申请号：	CN201910407978.2
公开号：	CN110058018A
代理机构：	郑州市华翔专利代理事务所(普通合伙)
代理人：	张爱军
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	450000 河南省郑州市金水区花园路116号
主权项：	1.一种动物流感抗体阻断检测试纸，由支撑板、抗原垫、金标垫、检测膜和吸水垫构成，其特征在于，抗原垫上吸附流感病毒检测抗原，金标垫吸附胶体金标记的抗流感病毒单克隆抗体mAb1，检测膜上含有检测线T“\|”和质控线C“\|”印迹，检测线T为抗流感病毒单克隆抗体mAb2或抗流感病毒多克隆抗体pAb1印迹，质控线C为抗小鼠IgG兔抗体pAb2或金黄色葡萄球菌SPA印迹。 2.根据权利要求1所述的动物流感抗体阻断检测试纸，其特征在于，所述试纸以单克隆抗体阻断模式检测动物流感中和抗体，若在检测膜显现两条红色条带“\|\|”，且检测线T显色强度与空白对照相当，则为动物流感抗体阴性；若显现两条红色条带“\|\|”，但检测线T明显弱于空白对照，则为动物流感抗体弱阳性；若只显现一条红色条带“\|”，则为动物流感抗体强阳性。 3.根据权利要求1所述的动物流感抗体阻断检测试纸，其特征在于，抗流感病毒单克隆抗体mAb1具有血凝抑制HI和病毒中和VN活性，特异识别HA蛋白中和抗原表位；单克隆抗体mAb2具有血凝抑制HI活性，特异识别HA蛋白非中和抗原表位；抗原垫吸附流感病毒检测抗原，流感病毒检测抗原为流感病毒抗原、重组抗原或多肽抗原。 4.根据权利要求3所述的动物流感抗体阻断检测试纸，其特征在于，所述抗流感病毒单克隆抗体mAb1和mAb2的制备方法为： (1)流感病毒免疫抗原的制备以不同亚型流感病毒经尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，36～48h收取尿囊液，差速离心纯化病毒抗原，4℃3000r/min低速离心30min去除杂质，4℃60000r/min超速离心1h，用7mL0.01mol/L PBS(pH值7.2)重悬沉淀，以血凝试验测定流感病毒的HA效价达2-12以上； (2)抗流感病毒单克隆抗体的制备 (2.1)杂交瘤细胞株的建立将流感病毒灭活病毒或疫苗为免疫抗原，免疫小鼠，建立抗不同亚型流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株； (2.2)单克隆抗体的制备 (2.3)单克隆抗体的鉴定 (2.3.1)病毒反应谱以免疫过氧化物酶单层细胞试验测定单克隆抗体阳性克隆与不同亚型流感病毒的反应性，筛选获得识别广谱流感病毒单克隆抗体； (2.3.2)识别病毒蛋白以Western blot检测单克隆抗体识别流感病毒病毒蛋白； (2.3.3)血凝抑制HI活性以免疫过氧化物酶单层细胞试验测定单克隆抗体腹水的单抗效价，以血凝抑制试验HI测定单克隆抗体腹水的HI活性，筛选获得具有血凝抑制活性单克隆抗体，作为单克隆抗体mAb2，用于检测线T印迹； (2.3.4)病毒中和VN活性以病毒中和试验测定单克隆抗体腹水对不同亚型流感毒株的中和活性，筛选获得具有病毒中和活性单克隆抗体，作为单克隆抗体mAb1，用于胶体金标记； (2.3.5)单克隆抗体亚型鉴定利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒测定流感病毒单克隆抗体的免疫球蛋白亚型； (2.3.6)抗原表位分析利用重叠合成多肽对单克隆抗体识别的抗原表位进行分析； (2.4)单克隆抗体的纯化以辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化单抗IgG。 5.根据权利要求3所述的动物流感抗体阻断检测试纸，其特征在于，流感病毒抗原为经甲醛或β-丙内酯BPL灭活的流感病毒尿囊液。 6.根据权利要求5所述的动物流感抗体阻断检测试纸，其特征在于，流感病毒抗原的具体制备方法为：以不同亚型流感病毒经尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，36～120h收取鸡胚尿囊液，4℃3000r/min低速离心30min，取上清，以血凝试验测定流感病毒的HA效价达2-12以上；分别在流感病毒尿囊液中加入终浓度为0.1％～0.5％的甲醛溶液或0.02％～0.2％的β-丙内酯，充分混匀，分别置于4℃灭活48h或37℃灭活9h，制备流感病毒灭活病毒抗原。 7.根据权利要求3所述的动物流感抗体阻断检测试纸，其特征在于，重组抗原为利用大肠杆菌表达纯化的HA重组蛋白。 8.根据权利要求7所述的动物流感抗体阻断检测试纸，其特征在于，重组抗原的具体制备方法为：根据不同亚型流感病毒HA基因序列合成经大肠杆菌密码子优化的HA基因，并亚克隆入大肠杆菌表达载体pET-28a构建重组表达质粒，将重组质粒pET28a-rHA转化大肠杆菌BL21(DE3)，以1mmol/L IPTG诱导表达HA重组蛋白，表达蛋白经8mol/L尿素变性溶解后经Ni-NTA亲和层析纯化，获得纯度90％的HA表达蛋白，以流感病毒抗原检测试纸测定其抗原活性，制备HA蛋白重组抗原。 9.根据权利要求3所述的动物流感抗体阻断检测试纸，其特征在于，多肽抗原为抗流感病毒单克隆抗体mAb1、mAb2抗原表位多肽与载体蛋白偶联的人工抗原，载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、免疫球蛋白IgG、卵清白蛋白OVA或钥孔血蓝蛋白KLH；其具体制备方法为：利用多肽合成仪以固相多肽合成方法合成单克隆抗体mAb1和mAb2抗原表位多肽，在多肽N端均加入Cys，用于载体蛋白偶联；将mAb1和mAb2的抗原表位多肽按摩尔比4:1、2:1、1:1、1:2和1:4不同比例混合，利用异型双功能试剂SMCC将多肽与牛血清白蛋白、免疫球蛋白、卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白按不同摩尔比进行偶联，获得不同多肽混合比的多肽偶联抗原，以Dot-Blot或流感病毒抗原检测试纸测定HA偶联多肽抗原活性，并测定抗流感病毒血清对胶体金标记抗体的阻断效率，获得最佳多肽配比和多肽/载体蛋白的偶联多肽抗原，制备HA蛋白多肽抗原。 10.根据权利要求1所述的动物流感抗体阻断检测试纸，其特征在于，抗原垫的制备方法为：将玻璃纤维棉切成条状，以含0.1mol/L NaCl、0.2％(v/v)Tween 20和0.1％(w/v)叠氮钠的PBS(pH7.2)溶液分别将流感病毒抗原、HA重组抗原和多肽抗原做系列稀释，并以15μL/cm将流感病毒检测抗原喷点于玻璃棉，干燥；将抗原垫置于塑料袋，加干燥剂室温密闭保存备用；利用吸附不同检测抗原的抗原垫装配试纸，以不同浓度抗流感病毒阳性血清测定试纸阻断效果，通过对不同抗原及其浓度的组合筛选，获得抗原垫的最佳工作浓度为：病毒抗原4log2 HA单位/100μL，重组抗原200μg/mL，多肽抗原100μg/mL。
所属类别：	发明专利