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原文传递 GHH对黑麦草吸收EE2与Cd的作用及验证方法

专利名称：	GHH对黑麦草吸收EE2与Cd的作用及验证方法
摘要：	本发明公开了一种GHH对黑麦草吸收EE2与Cd的作用及验证方法，运用本发明的验证方法验证得到黑麦草联合GHH能够修复EE2‑Cd复合污染土壤；GHH为保藏编号CCTCC NO：M2017539的生丝微菌属，命名为Hyphomicrobium sp.GHH；接种GHH显著促进了植物的生长，提高了黑麦草对EE2和Cd的提取效率；在土壤上种植黑麦草并接种GHH对脲酶活性和微生物量碳含量具有促进作用，能够改善土壤环境。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江工商大学
发明人：	何闪英;郭海慧;李渊;吕黎;柴奇伟;倪瑶琪;曹梦卓
专利状态：	有效
申请日期：	2018-09-25T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-05T00:00:00+0800
申请号：	CN201811114767.1
公开号：	CN109975086A
代理机构：	杭州裕阳联合专利代理有限公司
代理人：	姚宇吉
分类号：	G01N1/28(2006.01);G;G01;G01N;G01N1
申请人地址：	310000 浙江省杭州市江干区下沙高教园区学正街18号
主权项：	1.GHH对黑麦草吸收EE2与Cd的作用，其特征在于，包括：黑麦草联合GHH能够修复EE2-Cd复合污染土壤；所述GHH为保藏编号CCTCC NO：M2017539的生丝微菌属，命名为Hyphomicrobium sp.GHH。 2.根据权利要求1所述的GHH对黑麦草吸收EE2与Cd的作用，其特征在于，随着土壤中Cd浓度的升高，接种GHH的黑麦草对土壤中EE2和Cd的去除率降低，提取量增大。 3.根据权利要求1所述的GHH对黑麦草吸收EE2与Cd的作用，其特征在于，接种GHH能够促进黑麦草的生长，提高黑麦草对EE2和Cd的提取效率。 4.根据权利要求1所述的GHH对黑麦草吸收EE2与Cd的作用，其特征在于，在黑麦草的种子发芽第3天，每盆加入10mL的GHH菌悬液加入土壤中，第14天时补加一次。 5.根据权利要求4所述的GHH对黑麦草吸收EE2与Cd的作用，其特征在于，所述GHH菌悬液的OD600值为1。 6.根据权利要求1所述的GHH对黑麦草吸收EE2与Cd的作用，其特征在于，在土壤上种植黑麦草并接种GHH对脲酶活性和微生物量碳含量具有促进作用。 7.GHH对黑麦草吸收EE2与Cd的作用的验证方法，其特征在于，包括如下步骤：准备材料：配置含有EE2，Cd的土壤，种植黑麦草，接种GHH；所述GHH为保藏编号CCTCCNO：M2017539的生丝微菌属，命名为Hyphomicrobium sp.GHH；设置处理组：设置4个处理组，分别为：不添加GHH和不种植黑麦草的空白组，单独添加GHH，单独种植黑麦草，种植黑麦草并添加GHH；每个处理组均设3个平行，在黑麦草发芽后的第28d，收割取样，测定各项指标；测定植物生物量：收割植物清洗后，测定根长，烘干测重量；测定植物和土壤中EE2的含量；测定植物和土壤中Cd的含量；测定土壤中脲酶活性和微生物量碳。 8.根据权利要求7所述的GHH对黑麦草吸收EE2与Cd的作用的验证方法，其特征在于，测定植物和土壤中EE2的含量的具体方法包括：提取测定植物中EE2：将新鲜的植物样品在液氮中研磨均匀，取茎样或根样置于聚丙烯离心管中，加入去离子水和酸化乙腈，用涡旋混合器振荡混合，然后超声，加入盐萃取剂，并立即用涡旋混合器振荡，混合液离心后，冷冻放置1～2h，取上清液用膜滤过滤，滤液氮吹干燥后加入甲醇定容并进行测定；所述盐萃取剂包括：MgSO4，NaCl，Na3C6H5O7，C6H5Na2O7；提取测定土壤中EE2：取土样，在液氮中研磨均匀，取茎样或根样置于聚丙烯离心管中，加入去离子水和酸化乙腈，用涡旋混合器振荡混合，然后超声，加入盐萃取剂，并立即用涡旋混合器振荡，混合液离心后，将上清液转移到含有无水MgSO 4和C18的聚丙烯离心管中；涡旋离心后，取上清液进行氮吹干燥，加甲醇定容；所述盐萃取剂包括：MgSO4，CH3COONa； EE2的测定方法：使用高效液相色谱和色谱柱分析植物或土壤提取物中的EE2浓度。 9.根据权利要求7所述的GHH对黑麦草吸收EE2与Cd的作用的验证方法，其特征在于，测定植物和土壤中Cd的含量的具体方法包括：测定植物中Cd含量：将植物洗净分为根部和地上部分，剪碎放入烘箱中烘干，将烘干后的植物样品用粉碎机粉碎后，过筛待测；分别称取植物根部或地上部分，加HC1O4和HN03，用聚四氟乙烯消煮罐消煮至溶液完全澄清；消煮结束后，消煮液用滤膜过滤，将滤液转入容量瓶中，定容；测定土壤中Cd含量：取土壤样品，自然风干，过筛后，加入HNO3，HCIO4和HF，消煮至完全澄清；消煮液用滤膜过滤，将滤液转入容量瓶中，定容；用原子吸收光谱仪测定植物和土壤中Cd含量。 10.根据权利要求7所述的GHH对黑麦草吸收EE2与Cd的作用的验证方法，其特征在于，测定土壤中脲酶活性的具体方法包括：取风干土样，置于锥形瓶内，加入甲苯混匀，静置后加的尿素溶液和柠檬酸盐缓冲液，将样品置于培养箱中并充分摇匀，将混合物离心，取上清液并用蒸馏水稀释，将稀释的上清液转移至离心管中，加苯酚钠和次氯酸钠，将样品充分混匀，静置，用蒸馏水稀释，使用紫外-分光光度计测吸光度，根据标准曲线确定样品中NH3-N的浓度，脲酶活性U＝y×10×V×W×T，其中，y为NH3-N的浓度；10为稀释比；V为反应体系总体积；W为样品重量；T为反应时间；测定土壤中微生物量碳含量的具体方法包括：称取湿润土壤，放入锥形瓶中，加入精氨酸水溶液，将样品放置培养，取出放入冰箱中，放置，随后将样品取出放在室温下解冻，解冻完全后向溶液中加入KCl水溶液，震荡提取，将溶液置于离心管中离心分离，上清液用滤膜过滤，将滤液测定；滤液中铵含量用靛酚蓝比色法测定；结果计算为ω(C)＝0.01×NH4+-Nmg·kg-1，式中：ω(C)为微生物生物量碳Bc质量分数，mg·kg-1；0.01为精氨酸诱导氨化法转换为Bc的系数。
所属类别：	发明专利