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原文传递抗缪勒激素胶乳增强比浊法检测试剂盒及其制备使用方法

专利名称：	抗缪勒激素胶乳增强比浊法检测试剂盒及其制备使用方法
摘要：	本发明提供了一种抗缪勒激素胶乳增强比浊法检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，试剂R1：HEPES、KH2PO4、PEG6000、BSA等；试剂R2：HEPES、KH2PO4、PEG6000、交联山羊抗人AMH多克隆抗体的胶乳微球等。本发明还提供了一种抗缪勒激素胶乳增强比浊法检测试剂盒的制备、使用方法。本发明首次利用胶乳增强免疫透射比浊法来测定抗缪勒激素，可在全自动生化分析仪上使用，成本低廉、自动化高，能大大节省检测时间；并且，在高稳定性和高精密度情况下，相比ELISA产品具有更高的灵敏度，相比化学发光产品具有更好的特异性，大大提升了抗缪勒激素检测的临床应用价值。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	安徽;34
申请人：	安徽大千生物工程有限公司
发明人：	符修乐;吴瑶瑶;芮双印;王俊薇;陆大伟;郭荣芳;程虎;支新梅;高帆
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-11T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-05T00:00:00+0800
申请号：	CN201910289735.3
公开号：	CN109975536A
代理机构：	合肥兴东知识产权代理有限公司
代理人：	王伟
分类号：	G01N33/53(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	231200 安徽省合肥市经开区桃花工业园繁华大道工投·立恒工业广场B12C
主权项：	1.一种抗缪勒激素胶乳增强比浊法检测试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：试剂R1：其溶剂为纯化水；试剂R2：其溶剂为纯化水。 2.根据权利要求1所述的抗缪勒激素胶乳增强比浊法检测试剂盒，其特征在于，包括的成分及相应含量具体为：试剂R1：其溶剂为纯化水；试剂R2：其溶剂为纯化水。 3.根据权利要求1所述的抗缪勒激素胶乳增强比浊法检测试剂盒，其特征在于，还包括AMH校准品，包括的成分及相应含量为：其溶剂为纯化水。 4.根据权利要求3所述的抗缪勒激素胶乳增强比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述AMH校准品包括的成分及相应含量具体为：其溶剂为纯化水。 5.根据权利要求3所述的抗缪勒激素胶乳增强比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述AMH校准品中rAMH具体为重组人AMH蛋白，获取方法具体如下： ①人AMH基因的获取：参考GENBANK登录号NM_000479.4，上游添加酶切位点EcoRⅠ，下游添加酶切位点XhoⅠ，获得如SEQ ID NO.1所示基因序列；得到基因序列后，送基因公司合成，测序合格，获得目标基因序列； ②表达载体构建：使用EcoR I和XhoⅠ两种内切酶对合成的基因及pET-32a质粒进行双酶切，将双酶切产物使用连接酶连接，并导入BL21大肠埃希菌感受态细胞中；LB培养基37℃、220rpm发酵2h，涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板培养过夜，取氨苄青霉素LB平板上生长的单菌落，扩大培养后提取质粒进行基因测序，鉴定目的基因；当鉴定为阳性，即表示表达载体构建成功，记为pET-32a/rAMH工程菌； ③重组人AMH的表达和纯化：取经测序AMH阳性菌于含氨苄青霉素的LB培养基中37℃摇菌1h以复苏工程菌活性，在氨苄青霉素LB培养基中放大培养4h后测其OD值；当OD值达到1.0时，加入IPTG，32℃诱导表达5h，并收集细菌；取菌体，并加入质量体积比1:2的PBS来重悬沉淀，经高压均质机破碎，12000r/min离心取上清，即得带HIS标签的目的蛋白rAMH粗制品；在上述带HIS标签的目的蛋白rAMH粗制品中加入肠激酶，并于23℃环境下酶切过夜；酶切后，将粗制蛋白过滤处理后过GST亲和层析柱，并用第一Elution buffer梯度洗脱，收集rAMH峰；将上一步纯化的rAMH过脱盐柱，用脱盐柱缓冲液置换，再分别用Loading buffer平衡好柱体，上样后用第二Elution buffer梯度洗脱，收集rAMH峰；最后，将离子交换层析收集到的rAMH过分子筛层析柱，用第三Elution buffer收集rAMH峰；其中，所述第一Elutionbuffer的配方为：50mM Tris-Cl，40mM还原性谷胱甘肽，pH7.0；所述脱盐柱缓冲液的配方为：50mM Tris-Cl，pH9.0；所述Loading buffer的配方为：50mM Tris-Cl，pH7.0；所述第二Elution buffer的配方为：50mMTris-Cl、1M NaCl，pH7.0；所述第三Elution buffer的配方为：50mM Na2HPO4、0.15 M NaCl，pH7.0；使用AMH抗体为第一抗体，使用HRP标记的山羊抗兔IgG为第二抗体做WB，当收集的上述rAMH蛋白样品在60kD处显示有阳性条带，即表明纯化后所得的rAMH为目标所需的重组人AMH蛋白；此时，加入20％甘油无菌分装，于-80℃保存备用。 6.根据权利要求1-5任一所述的抗缪勒激素胶乳增强比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述交联山羊抗人AMH多克隆抗体的胶乳微球的获取方法为：使用直径30～60nm的聚苯乙烯胶乳微球，并采用共价偶联法将山羊抗人AMH多克隆抗体交联到聚苯乙烯胶乳微球上。 7.根据权利要求6所述的抗缪勒激素胶乳增强比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述山羊抗人AMH多克隆抗体的制备方法为： (1)重组人AMH的制备 ①人AMH基因的获取：参考GENBANK登录号NM_000479.4，上游添加酶切位点EcoRⅠ，下游添加酶切位点XhoⅠ，获得如SEQ ID NO.1所示基因序列；得到基因序列后，送基因公司合成，测序合格，获得目标基因序列； ②表达载体构建：使用EcoR I和XhoⅠ两种内切酶对合成的基因及pET-32a质粒进行双酶切，将双酶切产物使用连接酶连接，并导入BL21大肠埃希菌感受态细胞中；LB培养基37℃、220rpm发酵2h，涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板培养过夜，取氨苄青霉素LB平板上生长的单菌落，扩大培养后提取质粒进行基因测序，鉴定目的基因；当鉴定为阳性，即表示表达载体构建成功，记为pET-32a/rAMH工程菌； ③重组人AMH的表达和纯化：取经测序AMH阳性菌于含氨苄青霉素的LB培养基中37℃摇菌1h以复苏工程菌活性，在氨苄青霉素LB培养基中放大培养4h后测其OD值；当OD值达到1.0时，加入IPTG，32℃诱导表达5h，并收集细菌；取菌体，并加入质量体积比1:2的PBS来重悬沉淀，经高压均质机破碎，12000r/min离心取上清，即得带HIS标签的目的蛋白rAMH粗制品；在上述带HIS标签的目的蛋白rAMH粗制品中加入肠激酶，并于23℃环境下酶切过夜；酶切后，将粗制蛋白过滤处理后过GST亲和层析柱，并用第一Elution buffer梯度洗脱，收集rAMH峰；将上一步纯化的rAMH过脱盐柱，用脱盐柱缓冲液置换，再分别用Loading buffer平衡好柱体，上样后用第二Elution buffer梯度洗脱，收集rAMH峰；最后，将离子交换层析收集到的rAMH过分子筛层析柱，用第三Elution buffer收集rAMH峰；其中，所述第一Elutionbuffer的配方为：50mM Tris-Cl，40mM还原性谷胱甘肽，pH7.0；所述脱盐柱缓冲液的配方为：50mM Tris-Cl，pH9.0；所述Loading buffer的配方为：50mM Tris-Cl，pH7.0；所述第二Elution buffer的配方为：50mMTris-Cl、1M NaCl，pH7.0；所述第三Elution buffer的配方为：50mM Na2HPO4、0.15 M NaCl，pH7.0；使用AMH抗体为第一抗体，使用HRP标记的山羊抗兔IgG为第二抗体做WB，当收集的上述rAMH蛋白样品在60kD处显示有阳性条带，即表明纯化后所得的rAMH为目标所需的重组人AMH蛋白；此时，加入20％甘油无菌分装，于-80℃保存备用； (2)山羊抗人AMH多克隆抗体的获得 ①山羊的免疫：选择7月龄、体重40～50kg的雌性山羊，取1mL 5mg/mL rAMH抗原与等量弗氏佐剂充分匀浆形成稳定乳液，记为乳化抗原；每只山羊于四蹄注射共2mL乳化抗原，进行第一次免疫；7日后进行第二次免疫，免疫方案如前；21日后进行第三次免疫，免疫方案如前；42日后进行第四次免疫，免疫方案如前；49日后进行第五次免疫，采用耳缘静脉注射2mL 2.5mg/mLrAMH抗原；55日取耳缘静脉血，使用琼脂双扩散法测抗体效价，测得效价1：32及以上，终止免疫；采用颈部静脉无菌放血法获得全血； ②多克隆抗体的纯化：将上述步骤获得的全血于室温划十字口静置2h，再取上清获得粗制血清；将粗制血清于4℃、3000r/min的条件下离心15min，再加入等体积的PBS混匀得混合液，并向混合液中缓慢滴加同等体积的饱和硫酸铵，4℃静置5h；于4℃、4200r/min条件下离心30min，上清弃去，将沉淀用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置3h后，再于4℃、4200r/min条件下离心30min；此时，弃去上清，并将沉淀用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置3h后，4℃、4200r/min离心30min；离心后的沉淀再用200mL的PBS溶解，并进一步装入10kD透析袋；最后，将其置于4℃环境下，采用20倍体积的PBS透析液透析6h除盐，即得山羊抗人AMH多克隆抗体； ③多克隆抗体的验证：使用上述制备的rAMH为抗原，上述制备的山羊抗人AMH多克隆抗体为第一抗体，使用HRP标记的驴抗山羊IgG为第二抗体做WB，抗原在60kD处有阳性条带产生；因rAMH已经商品化抗体验证，且无其他标签蛋白，使用多克隆抗体验证rAMH同样出现阳性条带，表明山羊抗人AMH多克隆抗体制备成功。 8.一种如权利要求1-7任一所述的抗缪勒激素胶乳增强比浊法检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤： (1)重组人AMH的制备 ①人AMH基因的获取：参考GENBANK登录号NM_000479.4，上游添加酶切位点EcoRⅠ，下游添加酶切位点XhoⅠ，获得如SEQ ID NO.1所示基因序列；得到基因序列后，送基因公司合成，测序合格，获得目标基因序列； ②表达载体构建：使用EcoR I和Xho Ⅰ两种内切酶对合成的基因及pET-32a质粒进行双酶切，将双酶切产物使用连接酶连接，并导入BL21大肠埃希菌感受态细胞中；LB培养基37℃、220rpm发酵2h，涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板培养过夜，取氨苄青霉素LB平板上生长的单菌落，扩大培养后提取质粒进行基因测序，鉴定目的基因；当鉴定为阳性，即表示表达载体构建成功，记为pET-32a/rAMH工程菌； ③重组人AMH的表达和纯化：取经测序AMH阳性菌于含氨苄青霉素的LB培养基中37℃摇菌1h以复苏工程菌活性，接着在氨苄青霉素LB培养基中放大培养4h后测其OD值；当OD值达到1.0时，加入IPTG，32℃诱导表达5h，并收集细菌；取菌体，并加入质量体积比1:2的PBS来重悬沉淀，经高压均质机破碎，12000r/min离心取上清，即得带HIS标签的目的蛋白rAMH粗制品；在上述带HIS标签的目的蛋白rAMH粗制品中加入肠激酶，并于23℃环境下酶切过夜；酶切后，将粗制蛋白过滤处理后过GST亲和层析柱，并用第一Elution buffer梯度洗脱，收集rAMH峰；将上一步纯化的rAMH过脱盐柱，用脱盐柱缓冲液置换，再分别用Loading buffer平衡好柱体，上样后用第二Elution buffer梯度洗脱，收集rAMH峰；最后，将离子交换层析收集到的rAMH过分子筛层析柱，用第三Elution buffer收集rAMH峰；其中，所述第一Elutionbuffer的配方为：50mM Tris-Cl，40mM还原性谷胱甘肽，pH7.0；所述脱盐柱缓冲液的配方为：50mM Tris-Cl，pH9.0；所述Loading buffer的配方为：50mM Tris-Cl，pH7.0；所述第二Elution buffer的配方为：50mMTris-Cl、1M NaCl，pH7.0；所述第三Elution buffer的配方为：50mM Na2HPO4、0.15 M NaCl，pH7.0；使用AMH抗体为第一抗体，使用HRP标记的山羊抗兔IgG为第二抗体做WB，当收集的上述rAMH峰蛋白样品在60kD处显示有阳性条带，即表明纯化后所得的rAMH为目标所需的重组人AMH蛋白；此时，加入20％甘油无菌分装，于-80℃保存备用； (2)山羊抗人AMH多克隆抗体的获得 ①山羊的免疫：选择7月龄、体重40～50kg的雌性山羊，取1mL5mg/mL rAMH抗原与等量弗氏佐剂充分匀浆形成稳定乳液，记为乳化抗原；每只山羊于四蹄注射共2mL乳化抗原，进行第一次免疫；7日后进行第二次免疫，免疫方案如前；21日后进行第三次免疫，免疫方案如前；42日后进行第四次免疫，免疫方案如前；49日后进行第五次免疫，采用耳缘静脉注射2mL2.5mg/mL rAMH抗原；55日取耳缘静脉血，使用琼脂双扩散法测抗体效价，测得效价1：32及以上，终止免疫；采用颈部静脉无菌放血法获得全血； ②多克隆抗体的纯化：将上述步骤获得的全血于室温划十字口静置2h，再取上清获得粗制血清；将粗制血清于4℃、3000r/min的条件下离心15min，再加入等体积的PBS混匀得混合液，并向混合液中缓慢滴加同等体积的饱和硫酸铵，4℃静置5h；于4℃、4200r/min条件下离心30min，上清弃去，将沉淀用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置3h后，再于4℃、4200r/min条件下离心30min；此时，弃去上清，并将沉淀用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置3h后，4℃、4200r/min离心30min；离心后的沉淀再用200mL的PBS溶解，并进一步装入10kD透析袋；最后，将其置于4℃环境下，采用20倍体积的PBS透析液透析6h除盐，即得山羊抗人AMH多克隆抗体； ③多克隆抗体的验证：使用上述制备的rAMH为抗原，上述制备的山羊抗人AMH多克隆抗体为第一抗体，使用HRP标记的驴抗山羊IgG为第二抗体做WB，抗原在60kD处有阳性条带产生；因rAMH已经商品化抗体验证，且无其他标签蛋白，使用多克隆抗体验证rAMH同样出现阳性条带，表明山羊抗人AMH多克隆抗体制备成功； (3)交联山羊抗人AMH多克隆抗体的胶乳微球的制备使用直径30～60nm的聚苯乙烯胶乳微球，并采用共价偶联法将步骤(2)制得的山羊抗人AMH多克隆抗体交联到聚苯乙烯胶乳微球上，即得目标所需的交联山羊抗人AMH多克隆抗体的胶乳微球； (4)抗缪勒激素胶乳增强比浊法检测试剂盒的制备 ①配制试剂R1：按照试剂R1的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1； ②配制试剂R2：按照试剂R2的组分含量，将步骤(3)制得的交联山羊抗人AMH多克隆抗体的胶乳微球以及余下的其他组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R2； ③配制AMH校准品： AMH校准品包括的成分及相应含量如下：其溶剂为纯化水；按照试剂上述AMH校准品的组分含量，将步骤(1)制得的重组人AMH蛋白以及余下的其他组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得AMH校准品。 9.一种如权利要求1-7任一所述的抗缪勒激素胶乳增强比浊法检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下具体步骤： (1)吸取20μL样本，加入240μL试剂R1，37℃孵育5min； (2)再加入60μL试剂R2进行混合，并使其充分反应； (3)1min后读取吸光值A1，3min后读取吸光值A2，计算ΔA； (4)定标方法为6点定标，采用全自动生化分析仪进行检测，并设置校准品浓度分别为：0、1、2、4、8、16ng/mL；依据定标值，根据ΔA测算样本中AMH含量。
所属类别：	发明专利