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原文传递一种检测待测样本中目标抗体的免疫测定方法及其应用

专利名称：	一种检测待测样本中目标抗体的免疫测定方法及其应用
摘要：	本发明涉及生物技术领域的一种检测待测样本中目标抗体的免疫测定方法及其应用。所述方法包括将能够特异性识别人免疫复合物的第一抗体与由抗原和目标抗体所构成的第一免疫复合物中的目标抗体结合的步骤；其中，所述第一抗体不识别游离的人IgG以及游离的目标抗体。利用含该抗体的方法实现了间接法在均相免疫检测平台中的应用。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	博阳生物科技(上海)有限公司
发明人：	陈英豪;赵卫国;李会强;刘宇卉;李临
专利状态：	有效
申请日期：	2017-12-29T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-09T00:00:00+0800
申请号：	CN201711476497.4
公开号：	CN109991411A
代理机构：	北京聿宏知识产权代理有限公司
代理人：	吴大建;桑胜梅
分类号：	G01N33/558(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	201210 上海市浦东新区自由贸易试验区蔡伦路88号五楼东面
主权项：	1.一种检测待测样本中目标抗体的免疫测定方法，其包括将能够特异性识别人免疫复合物的第一抗体与由抗原和目标抗体所构成的第一免疫复合物中的目标抗体结合的步骤；其中，所述第一抗体不识别游离的人IgG以及游离的目标抗体。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一抗体通过识别表位与第一免疫复合物中的目标抗体结合，所述识别表位是构象表位和/或线性表位。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一抗体识别第一免疫复合物中目标抗体的恒定区部分。 4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第一抗体不识别第一免疫复合物中目标抗体的轻链部分。 5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第一抗体特异性识别第一免疫复合物中目标抗体的Fc段。 6.根据权利要求2-5中任意一项所述的方法，其特征在于，所述识别表位的的氨基酸序列包含5～10个氨基酸。 7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： S1，将已知抗原与待测样本中的目标抗体结合，形成由已知抗原-目标抗体构成的第一免疫复合物； S2，将第一抗体与所述第一免疫复合物结合，形成由已知抗原-目标抗体-第一抗体所构成的第二免疫复合物； S3，检测第二免疫复合物是否存在；如果第二免疫复合物存在，则表明待测样本中存在目标抗体。 8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S3中通过化学发光的方法检测第二免疫复合物是否存在。 9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第一免疫复合物与受体结合，所述受体能够与单线态氧反应生成可检测的化学发光信号。 10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒。 11.根据权利要求7-10中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第二免疫复合物与供体结合，所述供体能够在激发状态产生单线态氧。 12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述供体为光活化的或化学活化的敏化剂，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述供体为填充有感光化合物的高分子微粒，在光激发下能够产生单线态氧。 13.一种检测待测样本中目标抗体的均相免疫测定方法，其包括如下步骤： T1，将与受体结合的已知抗原与待检样本中的目标抗体结合，形成由受体-已知抗原-目标抗体构成的第三免疫复合物； T2，将特异性识别人免疫复合物的第一抗体与第三免疫复合物结合，形成由受体-已知抗原-目标抗体-第一抗体构成的第四免疫复合物； T3，将供体与第四免疫复合物结合，形成由受体-已知抗原-目标抗体-第一抗体-供体所构成的第五免疫复合物； T4，检测第五免疫复合物是否存在；如果第五免疫复合物存在，则待测样本中存在目标抗体。 14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，当第五免疫复合物存在时，用能量或者活性化合物激发供体产生单线态氧，所述受体与单线态氧反应生成可检测的化学发光信号。 15.根据权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述的方法具体包括如下步骤： (1)准备如下试剂： (i)待测样本； (ⅱ)第一组合物，其包含与第一标记物相结合的能够特异性识别人免疫复合物的第一抗体； (ⅲ)第二组合物，其包含与已知抗原相结合的受体，所述受体能与单线态氧反应生成检测信号，所述已知抗原能与目标抗体特异性结合； (ⅳ)第三组合物，其包含与第二标记物相结合的供体；所述供体能在激发状态下生成单线态氧；所述第二标记物能够与第一标记物特异性结合； (2)允许将试剂(i)、(ⅱ)和(ⅲ)相混合，如果待测样本中存在目标抗体，那么目标抗体将与已知抗原结合而形成由受体-已知抗原-目标抗体构成的第三免疫复合物；与第一标记物相结合的特异性识别人免疫复合物的第一抗体识别所述第一免疫复合物中的目标抗体，从而与第三免疫复合物结合形成由受体-已知抗原-目标抗体-第一抗体构成的第四免疫复合物； (3)允许将试剂(ⅳ)和所述第四免疫复合物相混合，通过第二标记物与第一标记物的特异性结合，使供体与第四免疫复合物中特异性识别人免疫复合物中的第一抗体间接结合，进而使供体能够靠近受体，形成由受体-已知抗原-目标抗体-第一抗体-供体构成的第五免疫复合物； (4)利用能量或活性化合物激发所述供体生成单线态氧，第五免疫复合物中的受体与接触的单线态氧反应产生可检测的化学发光信号； (5)任选地重复步骤(2)-(4)； (6)分析化学发光信号值，从而判断待测样本中是否存在目标抗体和/或目标抗体的浓度。 16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述第一标记物和第二标记物中的任一种为生物素，另一种为链霉亲和素；优选地，所述第一标记物为生物素，第二标记物为链霉亲和素。 17.根据权利要求13～16中任意一项所述的方法，其特征在于，利用600～700nm波长的激发光照射第五免疫复合物，激发供体产生单线态氧，受体与接触到的单线态氧反应生成520～620nm的发射光，检测发射光的信号值，从而判断测待测样本中是否存在目标抗体和/或目标抗体的浓度。 18.根据权利要求1-17中任意一项所述的方法，其特征在于，所述特异性识别人免疫复合物的第一抗体为多克隆抗体和/或单克隆抗体；优选地，所述第一抗体为单克隆抗体。 19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述多克隆抗体的制备方法包括：用人免疫复合物对动物进行免疫，获取含有所述多克隆抗体的动物血清；然后所述动物血清经亲和层析纯化得到特异性识别人免疫复合物的多克隆抗体。 20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述多克隆抗体的制备方法具体包括以下步骤： S1，用第一组人免疫复合物对动物进行免疫，免疫结束后，收集动物血清； S2，将所述动物血清上样至结合有第二组人免疫复合物的亲和层析柱上，经洗涤、洗脱后，获得含特异性识别人免疫复合物的多克隆抗体的洗脱液； S3，将所述洗脱液经透析后上样至抗人IgG亲和层析柱上，穿透液中获得特异性识别人免疫复合物的多克隆抗体。 21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述结合有第二组人免疫复合物的亲和层析柱的制备方法为：将与免疫时不同的抗原固定在亲和层析柱上，然后将与所述抗原特异反应的阳性人血清上样至所述亲和层析柱上，使阳性人血清中的特异性抗体与所述抗原形成第二组人免疫复合物，获得结合有第二组人免疫复合物的亲和层析柱。 22.根据权利要求20或21所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述动物血清上样前通过盐析进行粗提。 23.根据权利要求20-22中任意一项所述的方法，其特征在于，所述动物对人IgG免疫耐受。 24.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述单克隆抗体的制备方法包括：将经人免疫复合物免疫后的小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后进行培养，对细胞培养上清液进行检测，保留阳性细胞株。 25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述单克隆抗体的制备方法具体包括以下步骤： T1，用第一组人免疫复合物对小鼠进行免疫，免疫结束后，获取小鼠的脾脏细胞； T2，将小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后进行克隆培养，获得细胞培养上清液； T3，利用表面结合有第二组人免疫复合物的酶标板对所述细胞培养上清液进行间接法ELISA检测，获得阳性反应克隆； T4，将所述阳性反应克隆分别与表面结合有与步骤T3相同抗原的酶标板和表面结合有人IgG的酶标板进行间接法ELISA检测，舍弃有任意一项为阳性反应的所述阳性反应克隆； T5，剩余的阳性反应克隆的稳定细胞株经培养或制备腹水，获得特异性识别人免疫复合物的单克隆抗体。 26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述表面结合有第二组人免疫复合物的酶标板的制备方法为：将与免疫时不同的抗原结合到酶标板上，然后加入与所述抗原特异反应的阳性人血清，反应后洗涤，获得表面结合有第二组人免疫复合物的酶标板。 27.根据权利要求25或26所述的方法，其特征在于，步骤T2中，所述小鼠骨髓瘤细胞为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0。 28.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述单克隆抗体的制备方法包括：将经人免疫复合物免疫后的小鼠的脾脏细胞的总RNA反转录的cDNA为模板的PCR扩增产物克隆至噬菌体中；然后筛选出阳性噬菌体，并对阳性噬菌体上的抗体基因进行重组表达，获得特异性识别抗人免疫复合物的单克隆抗体。 29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述单克隆抗体的制备方法具体包括以下步骤： M1，用第一组人免疫复合物对小鼠进行免疫，免疫结束后，获取小鼠脾脏细胞的总RNA； M2，将所述总RNA反转录至cDNA后，以cDNA为模板，利用小鼠IgG特异性引物进行PCR扩增，获得扩增产物； M3，将扩增产物克隆至噬菌体中，并将克隆所得噬菌体与结合于固相表面的第二组人免疫复合物进行反应，获取阳性噬菌体； M4，将所述阳性噬菌体上的抗体基因进行重组表达和纯化，获得特异性识别人免疫复合物的单克隆抗体。 30.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，将与免疫时不同的抗原固定至固相表面，然后加入与所述抗原特异反应的阳性人血清，反应后洗涤，形成结合于固相表面的第二组人免疫复合物。 31.根据权利要求24-30中任意一项所述的方法，其特征在于，所述小鼠对人IgG免疫耐受。 32.一种检测待测样本中目标抗体的化学发光免疫检测仪，其利用如权利要求1-31中任意一项所述的方法检测待测样本中的目标抗体。 33.根据权利要求32所述的化学发光免疫检测仪，其特征在于，所述化学发光免疫检测仪为光激化学发光免疫检测仪。 34.一种如权利要求1-12中任意一项所述的免疫测定方法、如权利要求13-31中任意一项所述的均相免疫测定方法或如权利32或33所述的检测仪在检测人血清或血浆中的目标抗体中的应用。
所属类别：	发明专利