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原文传递一种鉴定稻米品质差异蛋白的方法

专利名称：	一种鉴定稻米品质差异蛋白的方法
摘要：	本发明提供了一种鉴定稻米品质差异蛋白的方法，涉及植物生物技术领域，包括以下步骤：(1)提取不同水稻的籽粒的蛋白质；(2)对所述步骤(1)得到的蛋白质分别进行酶解，分别得到酶解物；将分别得到的酶解物进行iTRAQ标记，分别得到标记物，将分别得到的标记物进行混合，分别得到样品混合物；(3)对所述步骤(2)分别得到的样品混合物进行强阳离子交换柱分级，将分别得到的分级后的样品进行质谱检测，分别得到质谱检测结果；(4)对所述步骤(3)分别得到的质谱检测结果进行数据查库和定量分析，鉴定出稻米品质差异蛋白。本发明的方法能够鉴定出不同稻米品质的差异蛋白，从而根据差异蛋白快速有效地筛选与水稻品质相关的候选基因。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	湖北省农业科学院粮食作物研究所
发明人：	闸雯俊;杨国才;蔡海亚;游艾青;徐华山;徐得泽;李三和;周雷;李培德;刘凯;陈志军
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-24T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-16T00:00:00+0800
申请号：	CN201910333250.X
公开号：	CN110018256A
代理机构：	北京高沃律师事务所
代理人：	吕纪涛
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	430000 湖北省武汉市洪山区南湖大道3号
主权项：	1.一种鉴定稻米品质差异蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)提取不同水稻的籽粒的蛋白质； (2)对所述步骤(1)得到的蛋白质分别进行酶解，分别得到酶解物；将分别得到的酶解物进行iTRAQ标记，分别得到标记物，将分别得到的标记物进行混合，分别得到样品混合物； (3)对所述步骤(2)分别得到的样品混合物进行强阳离子交换柱分级，将分别得到的分级后的样品进行质谱检测，分别得到质谱检测结果； (4)对所述步骤(3)分别得到的质谱检测结果进行数据查库和定量分析，鉴定出稻米品质差异蛋白。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中水稻的品种包括鄂中5号和桂朝2号。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中强阳离子交换柱分级的过程包括：将交换柱经强阳离子色谱柱平衡缓冲液A平衡25min；将样品混合物300μL用强阳离子色谱柱平衡缓冲液B稀释7倍后，调pH值至2.5，离心取上清液进行梯度洗脱，0～3min，缓冲液B的体积分数由0％升至5％；3～21min，缓冲液B的体积分数由5％升至20％；21～27min，缓冲液B的体积分数由20％升至30％；27～33min，缓冲液B的体积分数由30％升至100％。 4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液A含有5mmol/L KH2PO4水溶液pH2.55，体积比为20％的乙腈。 5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液B含有5mmol/L KH2PO4水溶液pH2.75，体积比为20％的乙腈，600mmol/L KCl。 6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述洗脱的流速为0.2ml/min。 7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中质谱检测的过程包括：将所述分级后的样品进行液相色谱线性梯度洗脱，0～5min，B相体积分数保持3％不变；5～6min，B相体积分数由3％升至5％；6～36min，B相体积分数由5％升至20％；36～46min，B相体积分数由20％升至30％；46～50min，B相体积分数由30％升至80％，在之后的5min内B相体积分数保持不变；55～55.5min，B相体积分数由80％降至3％，在之后的19.5min内B相体积百分数保持3％不变；所述液相色谱线性梯度洗脱中A相为体积分数为99.9％的ddH2O和0.1％的甲酸；B相为体积分数为99.9％的乙腈和0.1％的甲酸。 8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述液相色谱洗脱的流速为300nL/min。 9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述质谱检测的质谱全扫描范围m/z＝350～1800，全扫描中选择离子强度前20位的母离子用标准碰撞能为30eV的HCD模式碎裂后，进行二级质谱序列测定，报告离子的比例进行定量。 10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)对质谱检测结果进行数据查库、定量分析的过程包括：用ProteinPilot软件的Paragon算法进行肽段、蛋白鉴定和定量，检索数据库为NCBI水稻种属非冗余数据库；搜索参数设置如下：胰蛋白酶，全酶切方式，最大漏切为2，固定修饰为半胱氨酸的甲基甲基硫代甲砜烷基化，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，肽段N端和赖氨酸的iTRAQ修饰；为降低假阳性结果，蛋白鉴定标准设定为ProtScore≥1.3，同时最少使用2条置信度≥95％的肽段进行蛋白定量；结果经过自动偏离校正以便消除标记样品混合时引入的误差。
所属类别：	发明专利