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原文传递一种用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法

专利名称：	一种用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法
摘要：	本发明属于免疫学检测技术领域，涉及一种用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶‑凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法；步骤为：水解四甲氧基硅烷，制备得到抗DON抗体溶胶凝胶、兔抗HRP抗体溶胶凝胶和空白溶胶凝胶；然后取兔抗HRP抗体溶胶凝胶与空白溶胶凝胶混合后加入固相萃取小柱的筛板一上，去除磷酸盐缓冲液后盖上筛板二，构建控制层；将筛板三置于筛板二之上；取抗DON抗体溶胶凝胶与空白溶胶凝胶混合后加入固相萃取小柱的筛板三上，去除磷酸盐缓冲液后盖上筛板四，构建检测层，得到溶胶‑凝胶免疫亲和色谱柱；本发明不需要复杂的前处理和大型仪器的辅助，检测时间短、灵敏度和稳定性高，满足DON污染情况调查的可视化检测需求。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	江苏大学
发明人：	孟辉;黄珊;张祯;曾昆
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-20T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-16T00:00:00+0800
申请号：	CN201910212262.7
公开号：	CN110018306A
分类号：	G01N33/58(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	212013 江苏省镇江市京口区学府路301号
主权项：	1.一种用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： S1、将盐酸，蒸馏水和水解四甲氧基硅烷混合，在冰中声振，得到混合液A； S2、先将抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体加入磷酸盐缓冲液中，再加入步骤S1的混合液A，振荡，混合液A凝胶化得到胶体，进行第一次称重，室温保存后再次称重，直至胶体重量为第一次重量的50％，然后将胶体进行研磨，研磨后经筛网筛选，装入固相萃取小柱中，使用乙腈–水溶液和磷酸盐缓冲液进行清洗，得到的抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体溶胶凝胶，用磷酸盐缓冲液悬起，得到悬浮液B； S3、与步骤S2的操作相同，区别是使用兔抗辣根过氧化物酶抗体替代抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体，得到兔抗辣根过氧化物酶抗体溶胶凝胶，用磷酸盐缓冲液悬起，得到悬浮液C； S4、将磷酸盐缓冲液加入步骤S1的混合液A，振荡，混合液A凝胶化得到胶体，进行第一次称重，室温保存后再次称重，直至胶体重量为第一次重量的50％，然后将胶体进行研磨，研磨后经筛网筛选，装入固相萃取小柱中，使用乙腈–水溶液和磷酸盐缓冲液进行清洗，得到空白溶胶凝胶，用磷酸盐缓冲液悬起，得到悬浮液D； S5、首先取固相萃取小柱，然后将筛板一(1)放入固相萃取小柱中；将步骤S3制备的悬浮液C与步骤S4制备的悬浮液D按一定比例混合，加入固相萃取小柱的筛板一(1)上，去除磷酸盐缓冲液后盖上筛板二(2)，筛板一(1)与筛板二(2)之间的区域为控制层(5)；再取筛板三(3)置于筛板二(2)之上，两者之间留有一定距离；然后，将步骤S2制备的悬浮液B与步骤S4制备的悬浮液D按一定比例混合，加入固相萃取小柱的筛板三(3)上，去除磷酸盐缓冲液后盖上筛板四(4)，筛板三(3)与筛板四(4)之间的区域为检测层(6)，得到溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱。 2.根据权利要求1所述的用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述盐酸的浓度为0.04M；所述盐酸、蒸馏水和四甲氧基硅烷的体积比为0.1-0.3：0.5-1：3-4。 3.根据权利要求1所述的用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述在冰中声振的时间为20-30min。 4.根据权利要求1所述的用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体、磷酸盐缓冲液和混合液A的用量比为2-4mg：2-4mL：2-4mL；所述乙腈–水溶液中乙腈和水的体积比为2:3。 5.根据权利要求1所述的用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述兔抗辣根过氧化物酶抗体、磷酸盐缓冲液和混合液A的用量比为2-4mg：2-4mL：2-4mL。 6.根据权利要求1所述的用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述磷酸盐缓冲液和混合液A的体积比为1：1。 7.根据权利要求1所述的用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述筛网的目数为200目。 8.根据权利要求1所述的用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述悬浮液C与悬浮液D的体积比为1:70-80；所述悬浮液B与悬浮液D的体积比为1:100。 9.根据权利要求1所述的用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述悬浮液C与悬浮液D混合后加入固相萃取小柱的筛板一(1)上的总体积为200～300μL；所述悬浮液B与悬浮液D混合后加入固相萃取小柱的筛板三(3)上的总体积为200～300μL。 10.根据权利要求1所述的用于快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的溶胶-凝胶免疫亲和色谱柱的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述筛板三(3)与筛板二(2)之间的距离为1～3mm。
所属类别：	发明专利