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原文传递一种机体免疫功能评价的试剂盒及其使用方法和应用

专利名称：	一种机体免疫功能评价的试剂盒及其使用方法和应用
摘要：	本发明建立了一种机体免疫功能评价试剂盒及其及其使用方法和应用，该试剂盒使用Toll样受体激动剂刺激外周血单个核细胞，以IL‑6、IL‑10、IFN‑α为指标评估机体固有免疫反应；使用抗人CD3抗体和抗人CD28抗体刺激外周血单个核细胞后，以IL‑2、IL‑4、IL‑17a、IFN‑γ为指标评估机体T淋巴细胞反应；使用CD40L/BAFF/IL‑21/IL‑4蛋白刺激单个核细胞，以IgG1、IgG2评估机体B细胞分泌抗体能力。所有检测指标使用流式细胞仪进行检测。本发明中多指标联合应用，可以比较全面的评价机体的免疫细胞功能。本试剂盒操作简单，能够同时进行多份样本的评价。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	上海市公共卫生临床中心
发明人：	徐建青;张晓燕;邱趁丽
专利状态：	有效
申请日期：	2019-02-01T00:00:00+0800
发布日期：	2019-04-23T00:00:00+0800
申请号：	CN201910103603.7
公开号：	CN109668819A
代理机构：	北京德崇智捷知识产权代理有限公司
代理人：	王斌
分类号：	G01N15/14(2006.01);G;G01;G01N;G01N15
申请人地址：	201508 上海市金山区漕廊公路2901号科研楼308室
主权项：	1.一种机体免疫功能评价试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括Toll样受体激动剂、抗人CD3抗体和CD28抗体、以及CD40配体、B细胞活化因子、IL-21和IL-4。 2.根据权利要求1所述机体免疫功能评价试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中Toll样受体激动剂包括但不限于TLR1/2激动剂、TLR4激动剂、TLR9激动剂；上述激动剂可单独使用，也可联合使用。 3.根据权利要求1所述机体免疫功能评价试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中抗人CD3抗体和CD28抗体是包被在磁珠或培养皿上进行使用的。 4.根据权利要求2所述机体免疫功能评价试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中TLR1/2激动剂包括但不限于 LPS-PG 、 LTA-SA standard 、 PGN-SA 或Pam3CK4； TLR4激动剂包括但不限于LPS; TLR9激动剂包括但不限于ODN 2216、ODN2206、ODN2243或ODN2395。 5.根据权利要求1所述机体免疫功能评价试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在评价人体免疫功能时，评价指标分三类，其中Toll样受体激动剂用于评价天然免疫，其评价指标为:IL-6、IL-10、IFN-α；抗人CD3和CD28抗体用于评价T淋巴细胞功能，评价指标为：IL-2、IL-4、IL-17a、IFN-γ；CD40配体、B细胞活化因子、IL-21和IL-4用于评价B淋巴细胞功能，评价指标为：IgG1、IgG2。 6.根据权利要求1所述机体免疫功能评价试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中CD40配体、B细胞活化因子、IL-21和IL-4是通过转染了CD40L、BAFF、IL-21和IL-4基因的K562细胞分泌获得。 7.采用权利要求1-6所述机体免疫功能评价试剂盒对机体免疫功能进行评价的方法，其步骤如下：固有免疫的评价：（1）取待评价机体分离的PBMC培养于细胞培养板中；（2）在细胞中加入TLR1/2激动剂、TLR4 激动剂、TLR9激动剂，放置二氧化碳培养箱培养；（3）收集培养上清，检测培养上清中IL-6、IL-10、IFN-α的表达，使用流式细胞仪检测细胞因子的浓度；通过检测这些细胞因子产生的量来评价机体免疫功能；二、T细胞免疫的评价：（1）分离待评价机体的PBMC培养于细胞培养板中；（2）在细胞中加入抗人CD3抗体和抗人CD28抗体，放置二氧化碳培养箱培养；（3）收集培养上清；检测培养上清中IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ的表达，使用流式细胞仪检测细胞因子的浓度；通过检测这些细胞因子产生的量来评价机体免疫功能；三、B细胞分泌抗体能力的评价：（1）分离待评价机体的PBMC培养于细胞培养板中；（2）在细胞中加入CD40L、BAFF、IL-21和IL-4，放置二氧化碳培养箱培养24h；（3）收集培养上清；检测培养上清中IgG1、IgG2的分泌量，使用流式细胞仪检测IgG的浓度，通过检测IgG产生的量来评价机体免疫功能。 8.根据权利要求7所述采用机体免疫功能评价试剂盒对机体免疫功能进行评价的方法，其固有免疫的评价方法具体步骤如下：（1）取分离的PBMC放置96孔U底细胞培养板中，2×105细胞/孔，设置复孔；（2）在细胞中加入TLR1/2激动剂Pam3CSK4100ng/ml、TLR4 激动剂LPS 100ng/ml、TLR9激动剂ODN 22162.5μM，100ul培养体系，放置二氧化碳培养箱培养24h；（3）收集培养上清，使用细胞因子检测试剂盒按照操作说明检测培养上清中IL-6、IL-10、IFN-α的表达，使用流式细胞仪检测细胞因子的浓度，通过检测这些细胞因子产生的量来评价机体免疫功能。 9.根据权利要求7所述采用机体免疫功能评价试剂盒对机体免疫功能进行评价的方法，其T细胞免疫的评价方法具体步骤如下：（1）取分离的PBMC放置96孔U底细胞培养板中，2×105细胞/孔，设置复孔；（2）在细胞中加入抗人CD3抗体和抗人CD28抗体包被的磁珠，细胞与磁珠比例为1:1，100ul培养体系，放置二氧化碳培养箱培养24h；（3）收集培养上清，使用细胞因子检测试剂盒按照操作说明检测培养上清中IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ的表达，使用流式细胞仪检测细胞因子的浓度，通过检测这些细胞因子产生的量来评价机体免疫功能。 10.根据权利要求7所述采用机体免疫功能评价试剂盒对机体免疫功能进行评价的方法，其B细胞分泌抗体能力的评价方法具体步骤如下：（1）取分离的PBMC放置96孔U底细胞培养板中，2×105细胞/孔，设置复孔；（2）在细胞中加入转染了CD40L/BAFF/IL-21/IL-4的K562细胞，K562与PBMC的比例为1:1，100ul培养体系，放置二氧化碳培养箱培养24h；（3）收集培养上清，使用human Immunoglobulin Isotyping Panel - IgGs (4-plex）检测试剂盒按照操作说明检测培养上清中IgG1、IgG2的分泌量，使用流式细胞仪检测IgG的浓度，通过检测IgG产生的量来评价机体免疫功能。 11.权利要求1所述机体免疫功能评价试剂盒在评价机体免疫功能方面的应用。 12.权利要求11中评价机体免疫功能方面的应用，所述机体包括但不限于健康人、感染病人、癌症病人。
所属类别：	发明专利