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原文传递一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条及其制备和使用方法

专利名称：	一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条及其制备和使用方法
摘要：	一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条及其制备和使用方法。本发明属于免疫学检测领域。本发明是要解决现有的用于生物检测的纳米材料对生物体有光损伤和检测背景信号干扰高的技术问题。该侧流试纸条由聚氯乙烯支撑背板、检测垫、结合垫、样品垫和吸收垫组成；其中结合垫是负载有结合抗体的下转换α‑NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针和结合鼠IgG的下转换α‑NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针。本发明的测流试纸条，其检测线性范围也较宽，具有很强的适用性。对待测样品的体积要求少，检测所需时间短，能够实现床边检测，因此灵活性较强；不需要专业的人员进行操作，可用于医疗检测中。
专利类型：	发明专利
申请人：	哈尔滨工业大学
发明人：	陈冠英;曹宁;韩晓瑞
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T21:00:00+0805
申请号：	CN201911419212.2
公开号：	CN111044493A
代理机构：	哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司
代理人：	邓宇
分类号：	G01N21/63;G01N21/359;G;G01;G01N;G01N21;G01N21/63;G01N21/359
申请人地址：	150001 黑龙江省哈尔滨市南岗区西大直街92号
主权项：	1.一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条，其特征在于该侧流试纸条由聚氯乙烯支撑背板(1)、检测垫(2)、结合垫(3)、样品垫(4)和吸收垫(5)组成；其中检测垫(2)是由硝化纤维膜(2-1)及平行画在硝化纤维膜(2-1)上的检测线(2-2)和控制线(2-3)组成；检测线(2-2)是用浓度为1mg/mL～2mg/mL的血清标记物抗体画出的线，线宽为1mm～1.2mm，滴加体积量是1μL/cm～1.2μL/cm；控制线(2-3)是用浓度为1mg/mL～2mg/mL的IgG抗体溶液画出的线，线宽为1mm～1.2mm，滴加体积量是1μL/cm～1.2μL/cm；结合垫(3)是负载有结合抗体的下转换α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针和结合鼠IgG的下转换α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针；其中α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4是以CaF2/NaLnF4为壳、以α-NaLnF4：Nd,Yb为核的核壳结构纳米晶，α-NaLnF4：Nd,Yb是用Yb和Nd掺杂的α-NaLnF4，Yb的掺杂摩尔百分数为10％～90％，Nd的掺杂摩尔百分数为10％～90％；Ln为Y元素、Gd元素或Lu元素；检测垫(2)粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)的中部，在检测垫(2)的检测线(2-2)一侧，结合垫(3)与检测垫(2)搭接，样品垫(4)与结合垫(3)搭接；在检测垫(2)的控制线(2-3)一侧，吸收垫(5)与检测垫(2)搭接，结合垫(3)、样品垫(4)和吸收垫(5)也都粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)上。 2.如权利要求1所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于，该方法按以下步骤进行：一、制备核α-NaLnF4：Nd,Yb，其中Ln＝Y、Gd或Lu，所述α-NaLnF4：Nd,Yb中Yb元素的掺杂摩尔百分数为10％～90％，Nd元素的掺杂摩尔百分数为10％～90％： a、按照α-NaLnF4：Nd,Yb的化学计量比与Yb和Nd的掺杂浓度称取核稀土氧化物、氧化镱、氧化钕和三氟乙酸钠；所述核稀土氧化物为氧化钇、氧化钆或氧化镥； b、将核稀土氧化物、氧化镱和氧化钕溶于体积百分浓度为50％的三氟乙酸(TFA)水溶液中，加热至80～100℃，并在该温度下保持50min～70min，得到澄清溶液，然后将所得澄清溶液在氩气气氛下蒸发，得到粉末状三氟乙酸稀土盐(RE(TFA)3)； c、将三氟乙酸钠和步骤b得到的RE(TFA)3混合于容器中，然后加入油酸(OA)，油氨(OM)和十八烯(ODE)，加热至100～130℃，并在该温度下保持20min～40min，以除去其中的水和氧气，再加热至300～320℃，并在该温度下保持30min～50min，然后在氩气气氛下冷却至室温； d、将步骤c得到的液体转移到离心管中，加入乙醇超声震荡洗涤，再离心分离出固相物，重复乙醇震荡洗涤和离心分离操作2～3次，得到α-NaLnF4:Yb,Nd，将α-NaLnF4:Yb,Nd分散在正己烷中，得到α-NaLnF4:Yb,Nd分散液；二、制备核壳结构α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4，其中Ln为Y元素、Gd元素或Lu元素： e、将氧化钙或壳稀土氧化物溶于体积百分浓度为50％的三氟乙酸(TFA)水溶液中，在90～100℃下加热50min～70min，得到澄清的溶液，然后持续通入氩气使溶液完全挥发，在容器底部得到白色粉末，即三氟乙酸盐；所述壳稀土氧化物为氧化钇、氧化钆或氧化镥； f、待容器底部的白色粉末完全干燥后，加入步骤一(d)制备的α-NaLnF4:Yb,Nd分散液、OA和ODE，在氩气保护下加热到120～150℃，并在该温度下保持30min～60min，除去溶液中的氧气、水及正己烷，然后在升温速率为12K·min-1的条件下加热到300～320℃，并在该温度下保持60min～90min，停止反应； g、待步骤f得到的溶液自然冷却到室温，加入乙醇震荡洗涤，再离心分离出固相物，重复乙醇震荡洗涤和离心分离操作2～3次，得到核壳结构α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4，将核壳结构α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4分散在正己烷中，得到α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4分散液；三、组装稀土下转换发光探针： h、将α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4分散液和硝基四氟硼酸铵(NOBF4)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液混合振荡，得到混合液，然后向混合液中加入正己烷和甲苯，静置5min～10min后再离心分离出固相沉淀，将固相沉淀再分散在DMF中，得到α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4的DMF分散液； i、向步骤h得到的α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4的DMF分散液中加入聚丙烯酸(PAA)，加热到80～100℃，并在该温度下保持30min～60min，然后加入丙酮，静置后离心分离，将沉淀分散到水中，得到PAA包覆的纳米晶的水分散液； j、向步骤i得到的PAA包覆的纳米晶的水分散液中加入碳二亚胺(EDC)溶液和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶液，在温度为37℃的条件下反应4h，然后离心分离，将固相沉淀再分散在水中，得到活化的PAA包覆的纳米晶分散液； k、取步骤j得到的活化的PAA包覆的纳米晶分散液，加入血清标记物抗体溶液，在温度为37℃的条件下反应6h，然后离心分离，将固相沉淀再分散在水中，得到结合抗体的下转换α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针的水分散液； l、取步骤j得到的活化的PAA包覆的纳米晶分散液，加入鼠IgG溶液，在温度为37℃的条件下反应6h，然后离心分离，将固相沉淀再分散在水中，得到结合鼠IgG的下转换α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针的水分散液；四、组装基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条： m、以Tris缓冲液为溶剂，以S9表面活性剂、酪蛋白、PVP-K30、Tween-20为溶质配制混合溶液，将玻璃纤维膜在混合溶液中浸泡2h～4h，干燥，得到样品垫(4)； n、用浓度为10mmol/L的柠檬酸钠缓冲液为溶剂，以蔗糖、步骤三(k)得到的结合抗体的下转换α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针的水分散液、步骤三(l)得到的结合鼠IgG的下转换α-NaLnF4：Nd,Yb@CaF2/NaLnF4纳米晶探针的水分散液为溶质配制探针溶液，将玻璃纤维膜在探针溶液中浸泡2h～4h，然后在45～50℃的条件下干燥，得到结合垫(3)； o、用1mg/mL～2mg/mL的血清标记物抗体溶液按滴加体积量是1μL/cm～1.2μL/cm在硝化纤维膜(2-1)上画出宽度为1mm～1.2mm的画线，得到检测线(2-2)；再用1mg/mL～2mg/mL的鼠IgG抗体溶液按滴加体积量是1μL/cm～1.2μL/cm在硝化纤维膜(2-1)上画出平行于检测线(2-2)的宽度为1mm～1.2mm的画线，得到控制线(2-3)，得到检测垫(2)； p、将检测垫(2)粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)的中部，在检测垫(2)的检测线(2-2)一侧，将结合垫(3)粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)上，并使结合垫(3)与检测垫(2)搭接，样品垫(4)粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)上并使样品垫(4)与结合垫(3)搭接；在检测垫(2)的控制线(2-3)一侧，将吸收垫(5)粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)上并使吸收垫(5)与检测垫(2)搭接，得到基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条。 3.根据权利要求2所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于，步骤一(b)中所述核稀土氧化物、氧化镱与氧化钕的总的物质的量与三氟乙酸(TFA)水溶液的体积的比为0.5mmol：(8～12)mL。 4.根据权利要求2所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于，步骤一(c)中所述RE(TFA)3的物质的量与OA的体积比为0.5mmol：(6～10)mL；所述RE(TFA)3的物质的量与OM的体积比为0.5mmol：(6～10)mL；所述RE(TFA)3的物质的量与ODE的体积比为0.5mmol：(12～15)mL。 5.根据权利要求2所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于，步骤二(e)中所述氧化钙的物质的量与体积百分浓度为50％的三氟乙酸水溶液的体积的比为1mmol：(5～10)mL；所述壳稀土氧化物与体积百分浓度为50％的三氟乙酸水溶液的体积的比为1mmol：(20～30)mL。 6.根据权利要求2所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于，步骤二(f)中所述α-NaLnF4:Yb,Nd分散液中α-NaLnF4:Yb,Nd的物质的量与OA的体积的比为1mmol：(10～30)mL；α-NaLnF4:Yb,Nd分散液中α-NaLnF4:Yb,Nd的物质的量与ODE的体积的比为1mmol：(10～30)mL。 7.根据权利要求2所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于，步骤三(h)中所述α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4分散液中的α-NaLnF4:Yb,Nd@CaF2/NaLnF4物质的量与NOBF4的质量比为1mmol：(50～100)mg。 8.根据权利要求2所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于，步骤三(k)中所述活化的PAA包覆的纳米晶分散液中的活化的PAA包覆的纳米晶与血清标记物抗体的摩尔比为1：(50～60)。 9.根据权利要求2所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于，步骤三(l)中所述活化的PAA包覆的纳米晶分散液中的活化的PAA包覆的纳米晶与鼠IgG的摩尔比为1:60。 10.如权利要求1所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的使用方法，其特征在于，该使用方法具体步骤如下：将血清样品用Tris缓冲溶液进行稀释，然后取50μL～150μL滴加到侧流试纸条的样品层上，静置10min～20min，然后通过800nm的激光对侧流试纸条的检测线和控制线进行发射光谱测试，采集控制线和检测线在980nm处的发射光谱强度，首先观察控制线处的发光情况，如果控制线处无发光，则产品失效；如果控制线处有发光，再观察检测线处的发光情况，如果检测线处无发光，则待测样品中不含相应的血清标记物；如果检测线处有发光，则待测样品中含有相应的血清标记物，根据测得的发光强度与检测标准曲线对比，定量得到血清中标记物的浓度；其中所述血清样品与Tris缓冲溶液的体积的比为(2～3)：1。
所属类别：	发明专利