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原文传递一种纳米线生物传感器的制备方法及其应用

专利名称：	一种纳米线生物传感器的制备方法及其应用
摘要：	本发明涉及一种纳米线生物传感器的制备方法及其应用，属于生物测试技术领域。本发明的纳米线生物传感器的制备方法，根据所要检测的目标设计对应的单链核酸探针，即可对目标核酸进行检测。同时通过电加热的核酸解链和原位释放技术，可以在原位实现对目标核酸的连续动态检测，从而掌握目标核酸分子的浓度变化情况。本发明方法制备的纳米线生物传感器，可以便捷、快速的制备出所需的纳米线生物传感器，用于简单快速的实现生物标志物的解链与原位释放。可针对某一疾病的生物标志物，根据特定生物标志物的浓度变化来对被检测人进行早期诊断与预后，可广泛应用于如肿瘤早筛与预后监测、单细胞研究、辅助生殖中的胚胎培养发育等领域。
专利类型：	发明专利
申请人：	清华大学
发明人：	王晗;孙凯
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T19:00:00+0805
申请号：	CN201911370420.8
公开号：	CN111175347A
代理机构：	北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	罗文群
分类号：	G01N27/00;G01N27/02;G01N27/327;B82Y30/00;B82Y40/00;C23C14/35;C23C14/16;C23C14/04;G;B;C;G01;B82;C23;G01N;B82Y;C23C;G01N27;B82Y30;B82Y40;C23C14;G01N27/00;G01N27/02;G01N27/327;B82Y30/00;B82Y40/00;C23C14/35;C23C14/16;C23C14/04
申请人地址：	100084 北京市海淀区清华园1号
主权项：	1.一种纳米线生物传感器的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤： (1)制备硅基底： (1-1)将硅片先后用丙酮和异丙醇反复冲洗，用氮气吹干表面； (1-2)将干燥后的硅片放入氧化炉中，在硅片表面生长二氧化硅绝缘层，得到硅基底，二氧化硅绝缘层的厚度为100-1000纳米； (2)在步骤(1)的硅基底上制备信号采集电极和金属纳米线，包括以下步骤： (2-1)在铬板上采用制版方法，制备得到带有对齐标志的信号采集电极的掩模铬板，备用； (2-2)将步骤(1)的硅基底先后用丙酮和异丙醇反复冲洗三次，用氮气吹干表面，再放置于100-120℃的热板上保持1-2分钟，使硅基底完全干燥； (2-3)将干燥后的硅基底置于匀胶机上，在硅基底的表面旋涂电子束胶，在硅基底的表面形成300-400纳米厚的电子束胶薄层； (2-4)采用电子束曝光方法，在步骤(2-3)旋涂了电子束胶的硅基底的中央位置和对齐标志位置上，曝光出宽度为100-500纳米、长度为50-200微米的纳米线和对齐标志，将电子束曝光后的硅基底放入电子束显影液中将被曝光部分的电子束胶去除，在硅基底表面得到纳米线槽和对齐标志槽，用去离子水清洗，氮气吹干； (2-5)采用磁控溅射的方法，向步骤(2-4)的表面带有纳米线槽和对齐标志槽的硅基底上溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，在硅基底表面制备得到金属纳米线和对齐标志，使用丙酮和超声结合的方式进行清洗，将硅基底表面未被曝光部分的电子束胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在100-120℃的热板上保持90秒，完全干燥； (2-6)将步骤(2-5)的带有金属纳米线和对齐标志的硅基底置于匀胶机上，旋涂光刻胶(该光刻胶为负胶)，在硅基底表面形成1.3-1.5微米厚的光刻胶薄层；本发明的一个实施例中使用4340光刻胶，先以100转每分钟旋涂10秒钟，然后以4000转每分钟旋涂40秒； (2-7)将步骤(2-6)的带有旋涂光刻胶的硅基底放置于光刻机上，将步骤(2-1)信号采集电极的掩模铬板放置涂有光刻胶的硅基底上方，使硅基底上的对齐标志与信号采集电极的掩模铬板上的对齐标志对齐后，并使硅基底与信号采集电极的掩模铬板相互贴合，采用光刻方法，从信号采集电极的掩模铬板的上方进行光刻，再放入显影液中，将被未曝光部分的光刻胶去除，在硅基底表面制备得到信号采集电极槽，用去离子水清洗，氮气吹干； (2-8)采用磁控溅射方法，对带有信号采集电极槽的硅基底表面进行磁控溅射，先溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，采用丙酮和超声结合的方法进行清洗，将被曝光部分的光刻胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在硅基底上制备得到信号采集电极和金属纳米线； (3)制备一个引流块，其结构如图3所示，在引流块中加工第一通孔和第二通孔，引流块的底部加工凹槽，使凹槽的宽度与步骤(2)的金属纳米线的长度相等，凹槽的长度为4-6毫米，凹槽的深度为50-200微米，使该凹槽成为第一通孔与第二通孔之间的底部通道； (4)将步骤(3)的引流块的底部与步骤(2)的硅基底相对固定，使引流块的底部通道的长度方向与纳米线的长度方向相互垂直，并完全覆盖纳米线； (5)在步骤(4)的纳米线上连接探针，包括以下步骤： (5-1)向引流块的第一通孔中通入溶于磷酸缓冲盐溶液的生物素修饰的牛血清蛋白溶液，生物素修饰的牛血清蛋白溶液的质量体积浓度为200微克/毫升，使生物素修饰的牛血清蛋白溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，使生物素修饰的牛血清蛋白溶液在底部通道中室温下停留2小时，向引流块的第一通孔中通入磷酸缓冲盐溶液，使生物素修饰的牛血清蛋白溶液从第二通孔中流出； (5-2)向引流块的第一通孔中通入溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液，溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液的质量体积浓度为100微克/毫升，使溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液在底部通道中37℃下停留1小时，向引流块的第一通孔中通入磷酸缓冲盐溶液，使溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液从引流块的第二通孔中流出； (5-3)向引流块的第一通孔中通入溶于磷酸缓冲盐溶液的生物素修饰的探针溶液，探针溶液的摩尔浓度为1微摩/毫升，使探针溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，在室温下停留1小时，向引流块的第一通孔中通入磷酸缓冲盐溶液，使探针溶液从引流块的第二通孔中流出，此时探针连接上纳米线，得到纳米线生物传感器。 2.一种纳米线生物传感器的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤： (1)制备硅基底： (1-1)将硅片先后用丙酮和异丙醇反复冲洗，用氮气吹干表面； (1-2)将干燥后的硅片放入氧化炉中，在硅片表面生长二氧化硅绝缘层，得到硅基底，二氧化硅绝缘层的厚度为100-1000纳米； (2)在步骤(1)的硅基底上制备信号采集电极和金属纳米线，包括以下步骤： (2-1)在铬板上采用制版方法，制备得到带有对齐标志的信号采集电极的掩模铬板，备用； (2-2)将步骤(1)的硅基底先后用丙酮和异丙醇反复冲洗三次，用氮气吹干表面，再放置于100-120℃的热板上保持1-2分钟，使硅基底完全干燥； (2-3)将干燥后的硅基底置于匀胶机上，在硅基底的表面旋涂电子束胶，在硅基底的表面形成300-400纳米厚的电子束胶薄层； (2-4)采用电子束曝光方法，在步骤(2-3)旋涂了电子束胶的硅基底的中央位置和对齐标志位置上，曝光出宽度为100-500纳米、长度为50-200微米的纳米线和对齐标志，将电子束曝光后的硅基底放入电子束显影液中将被曝光部分的电子束胶去除，在硅基底表面得到纳米线槽和对齐标志槽，用去离子水清洗，氮气吹干； (2-5)采用磁控溅射的方法，向步骤(2-4)的表面带有纳米线槽和对齐标志槽的硅基底上溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，在硅基底表面制备得到金属纳米线和对齐标志，使用丙酮和超声结合的方式进行清洗，将硅基底表面未被曝光部分的电子束胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在100-120℃的热板上保持90秒，完全干燥； (2-6)将步骤(2-5)的带有金属纳米线和对齐标志的硅基底置于匀胶机上，旋涂光刻胶，在硅基底表面形成1.3-1.5微米厚的光刻胶薄层，先以100转每分钟旋涂10秒钟，然后以4000转每分钟旋涂40秒； (2-7)将步骤(2-6)的带有旋涂光刻胶的硅基底放置于光刻机上，将步骤(2-1)信号采集电极的掩模铬板放置涂有光刻胶的硅基底上方，使硅基底上的对齐标志与信号采集电极的掩模铬板上的对齐标志对齐后，并使硅基底与信号采集电极的掩模铬板相互贴合，采用光刻方法，从信号采集电极的掩模铬板的上方进行光刻，再放入显影液中，将被未曝光部分的光刻胶去除，在硅基底表面制备得到信号采集电极槽，用去离子水清洗，氮气吹干； (2-8)采用磁控溅射方法，对带有信号采集电极槽的硅基底表面进行磁控溅射，先溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，采用丙酮和超声结合的方法进行清洗，将被曝光部分的光刻胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在硅基底上制备得到信号采集电极和金属纳米线； (3)制备一个引流块，在引流块中加工第一通孔和第二通孔，引流块的底部加工凹槽，使凹槽的宽度与步骤(2)的金属纳米线的长度相等，凹槽的长度为4-6毫米，凹槽的深度为50-200微米，使该凹槽成为第一通孔与第二通孔之间的底部通道； (4)将步骤(3)的引流块的底部与步骤(2)的硅基底相对固定，使引流块的底部通道的长度方向与纳米线的长度方向相互垂直，并完全覆盖纳米线； (5)在步骤(4)的纳米线上连接探针，包括以下步骤： (5-1)向引流块的第一通孔中通入溶于纯乙醇的11-巯基十一烷酸溶液，溶于纯乙醇的11-巯基十一烷酸溶液的摩尔浓度为1毫摩尔/升，使溶于纯乙醇的11-巯基十一烷酸溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，溶于纯乙醇的11-巯基十一烷酸溶液在底部通道7中室温下停留1小时，向引流块的第一通孔中通入纯乙醇，使溶于纯乙醇的11-巯基十一烷酸从引流块的第二通孔中流出； (5-2)向引流块的第一通孔中通入摩尔浓度为50毫摩尔/升、pH＝5.0的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液，该溶液中包含摩尔浓度为100毫摩尔/升的N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和摩尔浓度为50毫摩尔/升的N-羟基丁二酰亚胺，使该溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，在底部通道7中室温下停留30分钟； (5-3)向引流块的第一通孔中通入溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液，溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液的质量体积浓度为100微克/毫升，使该溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，在底部通道7中室温下停留1小时，向引流块的第一通孔中通入磷酸缓冲盐溶液，使溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液从引流块的第二通孔中流出； (5-4)向引流块的第一通孔中通入溶于去离子水的甘氨酸溶液，溶于去离子水的甘氨酸溶液的摩尔浓度为1摩尔/升，使该溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，在底部通道7中室温下停留20分钟，向引流块的第一通孔中通入去离子水，使溶于去离子水的甘氨酸溶液从引流块的第二通孔中流出； (5-5)向引流块的第一通孔中通入溶于磷酸缓冲盐溶液的生物素修饰的探针溶液，探针溶液的摩尔浓度为1微摩尔/升，使探针溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，探针溶液在底部通道7中室温下停留1小时，向引流块的第一通孔中通入磷酸缓冲盐溶液，使探针溶液从引流块的第二通孔中流出，此时探针连接上纳米线，得到纳米线生物传感器。 3.一种纳米线生物传感器的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤： (1)制备硅基底： (1-1)将硅片先后用丙酮和异丙醇反复冲洗，用氮气吹干表面； (1-2)将干燥后的硅片放入氧化炉中，在硅片表面生长二氧化硅绝缘层，得到硅基底，二氧化硅绝缘层的厚度为100-1000纳米； (2)在步骤(1)的硅基底上制备信号采集电极和金属纳米线，包括以下步骤： (2-1)在铬板上采用制版方法，制备得到带有对齐标志的信号采集电极的掩模铬板，备用； (2-2)将步骤(1)的硅基底先后用丙酮和异丙醇反复冲洗三次，用氮气吹干表面，再放置于100-120℃的热板上保持1-2分钟，使硅基底完全干燥； (2-3)将干燥后的硅基底置于匀胶机上，在硅基底的表面旋涂电子束胶，在硅基底的表面形成300-400纳米厚的电子束胶薄层； (2-4)采用电子束曝光方法，在步骤(2-3)旋涂了电子束胶的硅基底的中央位置和对齐标志位置上，曝光出宽度为100-500纳米、长度为50-200微米的纳米线和对齐标志，将电子束曝光后的硅基底放入电子束显影液中将被曝光部分的电子束胶去除，在硅基底表面得到纳米线槽和对齐标志槽，用去离子水清洗，氮气吹干； (2-5)采用磁控溅射的方法，向步骤(2-4)的表面带有纳米线槽和对齐标志槽的硅基底上溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，在硅基底表面制备得到金属纳米线和对齐标志，使用丙酮和超声结合的方式进行清洗，将硅基底表面未被曝光部分的电子束胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在100-120℃的热板上保持90秒，完全干燥； (2-6)将步骤(2-5)的带有金属纳米线和对齐标志的硅基底置于匀胶机上，旋涂光刻胶，在硅基底表面形成1.3-1.5微米厚的光刻胶薄层，先以100转每分钟旋涂10秒钟，然后以4000转每分钟旋涂40秒； (2-7)将步骤(2-6)的带有旋涂光刻胶的硅基底放置于光刻机上，将步骤(2-1)信号采集电极的掩模铬板放置涂有光刻胶的硅基底上方，使硅基底上的对齐标志与信号采集电极的掩模铬板上的对齐标志对齐后，并使硅基底与信号采集电极的掩模铬板相互贴合，采用光刻方法，从信号采集电极的掩模铬板的上方进行光刻，再放入显影液中，将被未曝光部分的光刻胶去除，在硅基底表面制备得到信号采集电极槽，用去离子水清洗，氮气吹干； (2-8)采用磁控溅射方法，对带有信号采集电极槽的硅基底表面进行磁控溅射，先溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，采用丙酮和超声结合的方法进行清洗，将被曝光部分的光刻胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在硅基底上制备得到信号采集电极和金属纳米线； (3)在步骤(2)的纳米线上连接探针，包括以下步骤： (3-1)将两根导线分别放置于信号采集电极上，使用绝缘物质覆盖放有导线的信号采集电极，使纳米线暴露于外部，形成一个检测单元； (3-2)将检测单元放入溶有生物素修饰的牛血清蛋白的磷酸缓冲盐溶液中，溶有生物素修饰的牛血清蛋白的磷酸缓冲盐溶液的质量体积浓度为200微克/毫升，室温下静置2小时，取出检测单元，用磷酸缓冲盐溶液冲洗，去除检测单元表面的未反应的生物素修饰的牛血清蛋白； (3-3)将检测单元通放入溶有链霉亲和素的磷酸缓冲盐溶液中，溶有链霉亲和素的磷酸缓冲盐溶液的质量体积浓度为100微克/毫升，37℃下静置1小时，取出检测单元，用磷酸缓冲盐溶液冲洗，去除检测单元表面的未反应的链霉亲和素； (3-4)将检测单元放入溶有生物素修饰的探针的磷酸缓冲盐溶液中，该溶液的摩尔浓度为1微摩/毫升，37℃下静置一小时，在检测单元表面暴露的纳米线连接上探针，取出检测单元，用磷酸缓冲盐溶液冲洗，去除检测单元表面的未反应探针此时探针连接上纳米线，得到纳米线生物传感器。 4.一种纳米线生物传感器的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤： (1)制备硅基底： (1-1)将硅片先后用丙酮和异丙醇反复冲洗，用氮气吹干表面； (1-2)将干燥后的硅片放入氧化炉中，在硅片表面生长二氧化硅绝缘层，得到硅基底，二氧化硅绝缘层的厚度为100-1000纳米； (2)在步骤(1)的硅基底上制备信号采集电极和金属纳米线，包括以下步骤： (2-1)在铬板上采用制版方法，制备得到带有对齐标志的信号采集电极的掩模铬板，备用； (2-2)将步骤(1)的硅基底先后用丙酮和异丙醇反复冲洗三次，用氮气吹干表面，再放置于100-120℃的热板上保持1-2分钟，使硅基底完全干燥； (2-3)将干燥后的硅基底置于匀胶机上，在硅基底的表面旋涂电子束胶，在硅基底的表面形成300-400纳米厚的电子束胶薄层； (2-4)采用电子束曝光方法，在步骤(2-3)旋涂了电子束胶的硅基底的中央位置和对齐标志位置上，曝光出宽度为100-500纳米、长度为50-200微米的纳米线和对齐标志，将电子束曝光后的硅基底放入电子束显影液中将被曝光部分的电子束胶去除，在硅基底表面得到纳米线槽和对齐标志槽，用去离子水清洗，氮气吹干； (2-5)采用磁控溅射的方法，向步骤(2-4)的表面带有纳米线槽和对齐标志槽的硅基底上溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，在硅基底表面制备得到金属纳米线和对齐标志，使用丙酮和超声结合的方式进行清洗，将硅基底表面未被曝光部分的电子束胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在100-120℃的热板上保持90秒，完全干燥； (2-6)将步骤(2-5)的带有金属纳米线和对齐标志的硅基底置于匀胶机上，旋涂光刻胶，在硅基底表面形成1.3-1.5微米厚的光刻胶薄层，先以100转每分钟旋涂10秒钟，然后以4000转每分钟旋涂40秒； (2-7)将步骤(2-6)的带有旋涂光刻胶的硅基底放置于光刻机上，将步骤(2-1)信号采集电极的掩模铬板放置涂有光刻胶的硅基底上方，使硅基底上的对齐标志与信号采集电极的掩模铬板上的对齐标志对齐后，并使硅基底与信号采集电极的掩模铬板相互贴合，采用光刻方法，从信号采集电极的掩模铬板的上方进行光刻，再放入显影液中，将被未曝光部分的光刻胶去除，在硅基底表面制备得到信号采集电极槽，用去离子水清洗，氮气吹干； (2-8)采用磁控溅射方法，对带有信号采集电极槽的硅基底表面进行磁控溅射，先溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，采用丙酮和超声结合的方法进行清洗，将被曝光部分的光刻胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在硅基底上制备得到信号采集电极和金属纳米线； (3)在步骤(2)的纳米线上连接探针，包括以下步骤： (3-1)将两根导线分别放置于信号采集电极上，使用绝缘物质覆盖放有导线的信号采集电极，使纳米线暴露于外部，形成一个检测单元； (3-2)将检测单元放入溶有11-巯基十一烷酸的纯乙醇溶液中，溶有11-巯基十一烷酸的纯乙醇溶液的摩尔浓度为1毫摩尔/升，室温下静置1小时，取出检测单元，用纯乙醇冲洗检测单元，去除检测单元表面未反应的11-巯基十一烷酸； (3-3)将检测单元放入摩尔浓度为50毫摩尔/升、pH＝5.0的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)中，其中包含摩尔浓度为100毫摩尔/升的N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和摩尔浓度为50毫摩尔/升的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，室温下静置30分钟，取出检测单元； (3-4)将检测单元快速放入溶有链霉亲和素的磷酸缓冲盐溶液中，该溶液的质量体积浓度为100微克/毫升，室温下静置1小时，取出检测单元，用磷酸缓冲盐溶液冲洗检测单元，去除检测单元表面未反应的链霉亲和素； (3-5)将检测单元放入摩尔浓度为1摩尔/升的溶有甘氨酸的去离子水中，室温下静置20分钟，取出检测单元，用去离子水冲洗检测单元，去除检测单元表面未反应的甘氨酸； (3-6)将检测单元放入摩尔浓度为1微摩/毫升的溶有生物素修饰的探针的磷酸缓冲盐溶液中，37℃下静置一小时，在检测单元表面暴露的纳米线连接上探针，取出检测单元，用磷酸缓冲盐溶液冲洗检测单元，去除检测单元表面未反应的探针，得到纳米线生物传感器。 5.如权利要求1、2、3或4所述的纳米线生物传感器的制备方法，其特征在于其中所述的步骤(2-8)中的金属连接层为铬或钛，金属传感层为金或铂。 6.一种如权利要求1和2所述的纳米线生物传感器的应用，其特征在于该应用包括以下步骤： (1)向纳米线生物传感器中引流块的第一通孔中通入磷酸缓冲盐溶液(PBS)，使磷酸缓冲盐溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，采集纳米线生物传感器上信号采集电极的第一电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线； (2)向引流块的第一通孔中通入与纳米线生物传感器中探针相互补的目标序列，静置10分钟后，采集纳米线生物传感器上信号采集电极的第二电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线； (3)对纳米线生物传感器上的信号采集电极施加一个1-1.5伏的直流电压，施加时间为60-90秒，使目标序列从纳米线上释放，并从引流块的第二通孔中流出，采集信号采集电极的第三电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线； (4)向引流块的第一通孔中通入与纳米线生物传感器中探针相互补的目标序列，静置10分钟后，采集纳米线生物传感器上信号采集电极的第四电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线； (5)将上述第一电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线、第二电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线、第三电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线和第四电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线进行对比，实现核酸检测； (6)重复步骤(1)-(5)，进行目标核酸序列的多次重复检测。 7.一种如权利要求3和4所述的纳米线生物传感器的应用，其特征在于该应用包括以下步骤： (1)将纳米线生物传感器放入到细胞培养基中，采集纳米线生物传感器上信号采集电极的第一电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线； (2)根据设定的时间间隔，采集纳米线生物传感器上信号采集电极的多个电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线，记录多个电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线，通过对多个曲线进行对比，实现目标核酸序列的检测； (3)对纳米线生物传感器上的信号采集电极施加一个1-1.5伏的直流电压，施加时间为60-90秒，使目标序列从纳米线上释放； (4)重复步骤(1)-(3)，进行目标核酸序列的多次重复检测。
所属类别：	发明专利