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原文传递一种用于检测睾酮素的ELISA试剂盒的制备方法

专利名称：	一种用于检测睾酮素的ELISA试剂盒的制备方法
摘要：	本发明公开了一种用于检测睾酮素的ELISA试剂盒的制备方法，属于免疫分析快速检测技术领域。该试剂盒包括孔板、框架、吸水纸、滴管、试剂、说明书，睾酮单克隆抗体、辣根过氧化酶标记羊抗鼠抗体、睾酮标准溶液、底物液、显色液、终止液、浓缩洗涤液。本发明采用间接竞争ELISA检测方法，采用鸡卵清蛋白偶联肟化后的睾酮和高特异性睾酮单克隆抗体检测特异性强，检测范围宽，假阳性率低，可实现快速定量检测，且灵敏度高、误差小，为及时检测提供了极大的便利，能够真正地解决市场需要，适用于食品工业、环境保护和生物化学等领域。
专利类型：	发明专利
申请人：	江南大学
发明人：	孙秀兰;高璐;纪剑;张银志;孙嘉笛;徐诗荧;王利平
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T19:00:00+0805
申请号：	CN202010127257.9
公开号：	CN111175499A
代理机构：	哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司
代理人：	仇钰莹
分类号：	G01N33/558;G01N33/535;G01N33/577;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/558;G01N33/535;G01N33/577
申请人地址：	214000 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号
主权项：	1.一种用于检测睾酮素的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括孔板、框架、吸水纸、滴管、试剂，其中，所述孔板中包被睾酮半抗原与鸡卵清蛋白偶联得到的完全抗原，所述试剂包括睾酮单克隆抗体、辣根过氧化酶标记羊抗鼠抗体、睾酮标准溶液、底物液、显色液、终止液、浓缩洗涤液。 2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述底物液由醋酸钠、柠檬酸、双氧水配制而成。 3.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述显色液为乙二胺四乙酸。 4.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述终止液为硫酸溶液。 5.根据权利要求1-4任一所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为含吐温-80的磷酸盐缓冲液。 6.权利要求1所述ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： (1)睾酮标准品肟化后得到睾酮半抗原； (2)将步骤(1)中的睾酮半抗原与鸡卵清蛋白偶联得到睾酮包被抗原，将步骤(1)中的睾酮半抗原与牛血清蛋白偶联得到睾酮免疫抗原； (3)利用步骤(2)中的睾酮免疫抗原免疫小鼠得到睾酮特异性单克隆抗体； (4)将步骤(2)中的睾酮包被抗原包被在孔板上。 7.根据权利要求6所述试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括以下步骤：将睾酮标准品溶于无水吡啶，加入睾酮标准品1.5-2倍物质的量的羧甲基羟胺半盐酸，45-55℃搅拌反应30-40min，减压蒸馏去吡啶；残余物用乙酸乙脂溶解，加水洗涤，取上层油样，加入无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去乙酸乙脂，残余物用乙醚重结晶捣碎得到睾酮半抗原。 8.根据权利要求6所述试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括以下步骤： A液：睾酮半抗原用N，N二甲基甲酰胺搅拌溶解，加入三乙胺，3-5℃下反应1-1.5h，加人氯甲酸异丁脂，继续反应l-1.5h； B液：BSA、OVA分别溶于磷酸盐缓冲液中，加入N，N二甲基甲酰胺，3-5℃下搅拌反应1-1.5h；制备A液和B液，将A液逐滴滴加在B液中，3-5℃条件下反应4-5h；先后用磷酸缓冲液和蒸馏水透析2-2.5d，期间多次换液，冷冻干燥保存。 9.根据权利要求6所述试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(4)包括以下步骤：用碳酸盐缓冲液稀释睾酮包被抗原，滴加在孔板中，35-40℃孵育2-3h后倒去包被液，洗涤液清洗后拍干，封闭液滴加在孔板中，35-40℃孵育2-3h后洗涤拍干，其中，所述封闭液为牛血清蛋白溶液。 10.权利要求1所述试剂盒的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将标准品或样品加入孔板，后加入睾酮单克隆抗体，35-40℃孵育1-1.5h后洗涤拍干，每孔加入酶标二抗，35-40℃孵育30-40min后洗涤拍干，每孔先后加入底物液和显色液，15-20min后加终止液，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔OD值。
所属类别：	发明专利