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原文传递一种检测前列腺特异性抗原的夹心型电化学免疫传感器的制备及使用方法

专利名称：	一种检测前列腺特异性抗原的夹心型电化学免疫传感器的制备及使用方法
摘要：	本发明涉及生物领域，具体涉及一种检测前列腺特异性抗原的夹心型电化学免疫传感器的制备及使用方法。本发明通过在电极表面依次修饰上金纳米粒子负载的具有较好导电性的聚多巴胺和氮化硼复合物(Au@PDA@BCN)和对信号分子亚甲基蓝(MB)具有优良富集作用的金铂纳米粒子修饰的二氧化锰共价有机框架复合材料(AuPt@MnO2@TFPB‑COF)；通过两种材料实现对电化学信号的放大效果，所构建的使用肽和抗体的夹心型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器实现了精确定量检测前列腺特异性抗原的目的。
专利类型：	发明专利
申请人：	云南大学
发明人：	李灿鹏
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T13:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
申请号：	CN202010033287.3
公开号：	CN111198222A
代理机构：	成都市鼎宏恒业知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	富丽娟
分类号：	G01N27/327;G01N27/30;G01N27/48;G01N33/574;G;G01;G01N;G01N27;G01N33;G01N27/327;G01N27/30;G01N27/48;G01N33/574
申请人地址：	650000 云南省昆明市翠湖北路2号
主权项：	1.一种检测前列腺特异性抗原的夹心型电化学免疫传感器的制备方法：其特征在于：包括以下步骤： (1)玻碳电极的处理：将玻碳电极清洗干净； (2)将金纳米粒子负载聚多巴胺和氮化硼复合物的纳米材料分散液滴加至步骤(1)中清洗干净的玻碳电极表面，晾干； (3)将前列腺特异性抗体滴加到步骤(2)处理好的玻碳电极表面，进行孵育，孵育完成后用磷酸盐缓冲液清洗电极表面，晾干； (4)将牛血清蛋白溶液滴加到步骤(3)处理好的玻碳电极表面，进行孵育，孵育完成后用磷酸盐缓冲液清洗电极表面，晾干； (5)将前列腺特异性抗原溶液滴加到步骤(4)处理好的电极表面，进行孵育，孵育完成后用磷酸盐缓冲液清洗电极表面，晾干； (6)将肽的生物共轭探针滴加到步骤(5)处理好的电极表面，进行孵育，孵育完成后用磷酸盐缓冲液清洗电极表面，晾干，得到检测前列腺特异性抗原的夹心型电化学免疫传感器。 2.根据权利要求1所述的一种检测前列腺特异性抗原的夹心型电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)中，玻碳电极的处理具体为：将玻碳电极用的Al2O3抛光粉抛光，然后分别用硝酸溶液、乙醇溶液、超纯水超声清洗。 3.根据权利要求1所述的一种检测前列腺特异性抗原的夹心型电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：所述的步骤(2)金纳米粒子负载聚多巴胺和氮化硼复合物的纳米材料分散液的制备方法具体包括以下步骤： S1：在去离子水中加入HAuCl4溶液，在110℃条件下加热，然后加入柠檬酸钠溶液，在110℃条件下沸腾回流直至溶液变为酒红色，冷却后得到金纳米粒子分散液； S2：取4-吡啶基硼酸置于管式炉中，在氮气流的保护下将管式炉加热至800℃煅烧得到黑色的氮化硼； S3：按照质量份数比为1:2的比例分别称取步骤S2制备好的氮化硼和多巴胺，将两者分散在pH＝8.5的Tris盐酸缓冲液中，超声处理；然后在搅拌条件下缓慢加入步骤S1制备好的金纳米粒子分散液，搅拌至溶液变为黑色，经离心处理并洗涤，最终分散在去离子水中得到金纳米粒子负载聚多巴胺和氮化硼复合物的纳米材料分散液。 4.根据权利要求1所述的一种检测前列腺特异性抗原的夹心型电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)中，孵育条件为4℃条件下孵育12h。 5.根据权利要求1所述的一种检测前列腺特异性抗原的夹心型电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：所述的步骤(5)中，前列腺特异性抗原溶液的浓度为0.00005-10ng/mL。 6.根据权利要求1所述的一种检测前列腺特异性抗原的夹心型电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：所述的步骤(6)中，肽的生物共轭探针的制备方法具体包括以下步骤： N1：在烧瓶中加入1,2,4,5-四(4-甲酰基苯基)苯、对苯二胺，然后再加入体积比为1:1的均三甲苯和环氧己烷的混合溶剂，密封烧瓶并在超声处理，然后加入乙酸溶液，该混合物通过三次冷冻-融化循环脱气后加入氩气密封，并将烧瓶进行油浴，之后冷却过滤，用四氢呋喃和丙酮洗涤之后真空冷冻干燥得到浅黄色的粉末TFPB-COF； N2：取步骤N1制备好的TFPB-COF于烧杯中，再加入HClO4溶液，加入去离子水超声混合，然后在30℃水浴中将KMnO4加入溶液中，搅拌后再超声处理，最后滤出悬浮液并在60℃条件下干燥得到黑色粉末MnO2@TFPB-COF； N3：取步骤N2制备好的MnO2@TFPB-COF于烧瓶中，加入无水乙醇超声处理，再缓慢加入HAuCl4乙醇溶液和H2PtCl6乙醇溶液并超声处理，然后在冰浴中加入NaBH4乙醇溶液并超声处理，然后离心处理并用去离子水洗涤，最后重悬于pH＝7.0的PBS中得到AuPt@MnO2@TFPB-COF分散液； N4：将亚甲基蓝溶液滴加到步骤N3制备好的AuPt@MnO2@TFPB-COF分散液中并搅拌，然后离心处理并用pH＝7.0的PBS洗涤，最后分散在pH＝7.0的PBS中得到MB@MnO2@TFPB-COF分散液； N5：将前列腺特异性抗原亲和肽加入步骤N4制备的MB@MnO2@TFPB-COF分散液中，经搅拌后，离心处理并用pH＝7.0的PBS洗涤，得到肽的生物共轭探针。 7.根据权利要求1至6任意一项所述的检测前列腺特异性抗原的夹心型电化学免疫传感器的使用方法，其特征在于：包括以下步骤： T1：使用电化学工作站，在三电极体系中，以所制备的前列腺特异性抗原的夹心型电化学免疫传感器为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在pH＝7.0的磷酸盐缓冲液中进行测试； T2:利用差分脉冲伏安法对目标物进行检测，记录电流峰值； T3：记录不同浓度下的前列腺特异性抗原对应的电流峰值； T4：利用工作曲线法，得到待测样品中前列腺特异性抗原的浓度。 8.根据权利要求7所述的检测前列腺特异性抗原的夹心型电化学免疫传感器的使用方法，其特征在于：所述的步骤T1中，具体是在10mL浓度为0.1mol/L的pH＝7.0的磷酸盐缓冲液中进行测试。 9.根据权利要求7所述的检测前列腺特异性抗原的夹心型电化学免疫传感器的使用方法，其特征在于：所述的步骤T2中，扫描电压为-0.1～-0.6V，脉冲振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s。
所属类别：	发明专利