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原文传递一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学检测方法

专利名称：	一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学检测方法
摘要：	本发明公开一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学检测方法。该方法将Au NCs作为基底材料，因其良好的导电性促进光生电子的转移，利用巯基苯硼酸的巯基与金锥成键，硼酸键与抗体的氨基形成环状成键，使前列腺特异性抗原抗体(Ab1)固定到电极界面。壳聚糖(CS)具有模拟酶的效果，将TiO2‑B@CS‑Ag+复合物与二抗(Ab2)结合，形成光电化学探针。通过发生免疫反应，在模拟酶的作用下原位生成Ag2S；由于Ag2S能增敏TiO2‑B的光电信号，随着抗原浓度的增加，标记物浓度增加，光电信号不断增强。本发明方法可实现对前列腺特异性抗原浓度在1×10‑6 ng/mL–50 ng/mL范围内的检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	福建;35
申请人：	福建省妇幼保健院
发明人：	张书培;衣欢;高利红;戴宏;郑祥钦;宋建榕;韩晴
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-10T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-25T00:00:00+0800
申请号：	CN201910286210.4
公开号：	CN109932407A
代理机构：	福州智理专利代理有限公司
代理人：	王义星
分类号：	G01N27/30(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	350003 福建省福州市鼓楼区道山路18号福建省妇幼保健院
主权项：	1.一种基于原位信号放大的夹心型前列腺特异性抗原光电化学检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）玻碳电极（GCE）的预处理：GCE首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；（2） Au/Ab1/PSA修饰电极的制备：滴加3 μL金锥(Au NCs)溶液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，然后将3 μL巯基苯硼酸溶液滴涂到修饰过的电极表面，在4 °C下孵育50 min，用二次水清洗，去除多余的溶液，将修饰电极于5 μL浓度为1 mg/mL 的前列腺特异性抗原的抗体Ab1溶液中4 °C下孵育50 min，随后使用pH 7.4的磷酸缓冲溶液去除多余的前列腺特异性抗原的抗体Ab1，再将电极浸入20 μL 浓度为1.0 wt.%的牛血清白蛋白（BSA）溶液1 h，封闭电极表面上非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲去表面残余液后，即得到Au/Ab1修饰电极，将电极浸入5 μL不同浓度的前列腺癌细胞抗原（PSA）标准溶液中于4°C下孵育50 min，用pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，得到Au/Ab1/PSA修饰电极；（3） Au/Ab1/PSA/Ab2/Ag2S修饰电极的制备：称取一定量的TiO2-B固体粉末，用二次水分散均匀，配制成浓度为3 mg/mL的悬浮液，将TiO2-B溶液与壳聚糖溶液按照体积比为1:2的比例进行混合，摇匀30 min，反应好的溶液在转速为5000 rpm的转速下离心10min，去除多余的壳聚糖溶液，再加入一定量的二次水分散，形成TiO2-B@CS溶液；按照AgNO3溶液与TiO2-B@CS体积比为1:1的比例，将一定浓度的AgNO3溶液加入到TiO2-B@CS溶液中，摇匀反应30min，使Ag+充分吸附到TiO2-B表面，通过离心，去除多余的Ag+，再将固体用二次水分散均匀形成处理过的TiO2-B溶液；按照体积比为1:3的比例将前列腺特异性抗原二抗(Ab2)与处理过的TiO2-B溶液混合，在4°C下反应2h，离心去除未吸附的二抗，用pH为7.4的磷酸缓冲溶液分散，再加入一定量的BSA溶液封闭非活性位点，得到Ab2-TiO2-B@CS-Ag+溶液，放置冰箱待用；用移液枪吸取一定量的Ab2-TiO2-B@CS-Ag+溶液，滴涂到Au/Ab1/PSA修饰电极上，在4°C下孵育1 h，用二次水清洗，除去多余的物理吸附，得到Au/Ab1/PSA/Ab2电极；在室温下，将0.26 M的H2O2与0.2 M的AgNO3溶液一起滴涂到修饰的Au/Ab1/PSA/Ab2电极表面，反应15min，在H2O2与TiO2-B@CS的催化作用下，原位生成Ag2S，得到Au/Ab1/PSA/Ab2/Ag2S电极；（4）前列腺特异性抗原的检测：采用三电极体系进行测定，以Au/Ab1/PSA/Ab2/Ag2S修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为-0.1 V，每隔10 s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；在pH 7.4的 PBS缓冲溶液中，通过光电化学工作站进行检测1×10-6 ng/mL-50 ng/mL一系列不同浓度的前列腺特异性抗原标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替前列腺特异性抗原标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的TiO2-B材料的由下述方法制备的：TiO2纳米棒的制备用钛纳米线作为前驱体通过溶剂热法合成， 1 g TiO2分散到75 mL15 M的KOH水溶液中,摇匀10分钟后，得到的悬浮液转移到100 mL的反应釜中，将反应釜放置于170 °C下反应72 h，然后冷却至室温，得到的沉积物用醋酸溶液清洗直到pH为7.0，最终产物通过离心收集，在60 °C的鼓风烘箱中干燥12 h制得TiO2纳米线，然后取300 mg制得的TiO2纳米线前驱体分散在50mL浓度为8 M的醋酸溶液中，接着将溶液转移到反应釜中，加热到180 °C，反应24 h，得到的产物通过离心收集，用二次水和乙醇清洗，在60 °C下干燥一夜即得到TiO2-B。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金锥(Au NCs)由下述方法制备：在旋涂聚苯乙烯之前，首先将Teflon膜切割成1.5 cm x 1.5 cm正方形并用乙醇和二次水冲洗，然后用等离子水清洗3分钟。吸取1 mL浓度为2.5 w/v %的聚苯乙烯溶液并将其离心，再转移到乙醇和甲醇的体积比为2:1的混合溶液中。在溶液中加入体积比为0.2 %的表面活性剂(TX100)，接着将聚苯乙烯的浓度调节至约5 w/v %；然后将聚苯乙烯旋涂在清洁的Teflon膜上，并在室温下放置几分钟，使溶剂干燥；用O2等离子体蚀刻聚苯乙烯/Teflon表面一定时间；最后通过热蒸发在该表面涂上50 nm的金，得到金锥。 4.一种基于TiO2-B的前列腺特异性抗原光电化学生物传感器，包括工作电极、铂丝电极为对电极和Ag/AgCl为参比电极，其特征在于，所述的工作电极采用Au/Ab1/PSA/Ab2/Ag2S修饰电极，其由下述步骤的方法制备而成的1）玻碳电极的抛光：玻碳电极首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；2）Au/Ab1/PSA/Ab2/Ag2S修饰电极的制备：滴加3 μL金锥溶液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，然后将3 μL巯基苯硼酸溶液滴涂到修饰过的电极表面，在4 °C下孵育50 min，用二次水清洗，去除多余的溶液；将修饰电极于5 μL浓度为1 mg/mL 的前列腺特异性抗原的抗体Ab1溶液中4 °C下孵育50min，随后使用pH 7.4的磷酸缓冲溶液去除多余的前列腺特异性抗原的抗体Ab1，再将电极浸入20 μL 浓度为1.0 wt.%的BSA 1 h，封闭电极表面上非特异性活性位点，用二次水冲去表面残余液后，即得到Ab1/Au修饰电极；将电极浸入5 μL不同前列腺癌细胞抗原（PSA）标准溶液中于4 °C下孵育50 min；用pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，得到Au/ Ab1/PSA修饰电极；吸取5 μL标记过的二抗Ab2-TiO2-B@CS-Ag+滴涂到Au/Ab1/PSA修饰电极表面，在4 °C下孵育1 h，用pH 7.4的磷酸缓冲溶液洗去未反应的多余二抗，得到Au/Ab1/PSA/Ab2修饰电极；最后吸取5 μL 0.26 M的H2O2与0.18 M的S2O32-溶液一起滴涂到修饰的Au/Ab1/PSA/Ab2电极表面，反应15 min，在H2O2与TiO2-B@CS的催化作用下，原位生成Ag2S，得到Au/Ab1/PSA/Ab2/Ag2S电极。 5.权利要求1-3任一所述的方法制备的一种基于TiO2-B介观晶体的光电化学传感器用于前列腺特异性抗原的检测方法，其特征在于，步骤如下：1）采用三电极体系进行测定，以Au/Ab1/PSA/Ab2/Ag2S修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为0.1 V，每隔10 s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；2）在pH 7.4的 PBS缓冲溶液中，通过光电化学工作站进行检测1×10-6 ng/mL–50 ng/mL一系列不同溶度的前列腺特异性抗原标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替前列腺特异性抗原标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。
所属类别：	发明专利