详情

原文传递一种新型冠状病毒2019-nCoV的电化学检测方法

专利名称：	一种新型冠状病毒2019-nCoV的电化学检测方法
摘要：	本发明涉及一种新型冠状病毒2019‑nCoV的电化学检测方法，该检测方法包括针对新型冠状病毒2019‑nCoV RNA序列中两个结构域为靶标的三个探针设计、三种物质的制备和电化学传感器的构建。本发明针对新型冠状病毒2019‑nCoV的电化学检测具有操作简单、检测快速/准确、低成本的显著优点。
专利类型：	发明专利
申请人：	云南大学
发明人：	李灿鹏;赵卉;张亚平;刘凤;谢伟
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T21:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T22:00:00+0805
申请号：	CN202010108629.3
公开号：	CN111189900A
代理机构：	成都市鼎宏恒业知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	段和香
分类号：	G01N27/327;G01N27/48;G;G01;G01N;G01N27;G01N27/327;G01N27/48
申请人地址：	650000 云南省昆明市翠湖北路2号
主权项：	1.一种新型冠状病毒2019-nCoV的电化学检测方法，其特征在于，该检测方法包括针对新型冠状病毒2019-nCoV RNA序列中ORF1ab结构域为靶标的三个探针：捕获探针Captureprobe,CP、标签信号探针Labeled signal probe,LP和辅助探针Auxiliary probe,AP；其中： CP：5'-ACCTTTCCACATACCGCAGACG-3'； LP：5'-TCGAGTTACGCTAAGCGCGGAGTTGATCACAACTA-3'； AP：5'-CTTAGCGTAACTCGA-TAGTTGTGATCAACTCCGCG-3'。 2.一种新型冠状病毒2019-nCoV的电化学检测方法，其特征在于，该检测方法包括针对新型冠状病毒2019-nCoV RNA序列中N结构域为靶标的三个探针：捕获探针Capture probe,CP、标签信号探针Labeled signal probe,LP和辅助探针Auxiliary probe,AP；其中： CP：5'-CAATCTGTCAAGCAGCAGCA-3'； LP：5'-TCGAGTTACGCTAAG AGACATTTTGCTCTCAAGCT-3'； AP：5'-CTTAGCGTAACTCGA AGCTTGAGAGCAAAATGTCT-3'。 3.根据权利要求1或2所述的新型冠状病毒2019-nCoV的电化学检测方法，其特征在于，所述捕获探针Capture probe,CP和标签信号探针Labeled signal probe,LP的3’端使用巯基修饰。 4.根据权利要求1或2所述的新型冠状病毒2019-nCoV的电化学检测方法，其特征在于，该方法包括以下物质：Fe3O4纳米微球、金纳米粒子负载Fe3O4纳米复合物：Au@Fe3O4复合物、金纳米粒子/磺酸化杯[8]芳烃/还原氧化石墨烯/电信号物质复合物：Au@RGO-SCX8-电信号物质复合物。 5.根据权利要求4所述的新型冠状病毒2019-nCoV的电化学检测方法，其特征在于，所述的Fe3O4纳米微球的制备方法为：把三氯化铁水合物加入到乙二醇中形成澄清溶液，并加入乙酸钠和聚乙二醇，搅拌30～60分钟后，放入水热反应釜中加热反应，冷却到室温后得黑色沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀，干燥后得到Fe3O4纳米微球。 6.根据权利要求5所述的新型冠状病毒2019-nCoV的电化学检测方法，其特征在于，所述的Fe3O4纳米微球的制备方法包含以下参数：其中所述三氯化铁在乙二醇中的质量体积浓度为0.2％～0.5％，水热反应是在120～220℃下反应5～10小时，干燥是在60～100℃下处理6～10小时，乙酸钠与三氯化铁的质量比为3～6:1，聚乙二醇与三氯化铁的质量比为1:2～3:1。 7.根据权利要求4所述的新型冠状病毒2019-nCoV的电化学检测方法，其特征在于，所述的金纳米粒子负载Fe3O4纳米复合物的制备方法为：将Fe3O4纳米微球分散于超纯水中，超声分散均匀后，依次加聚乙二醇400、柠檬酸三钠、氯金酸和抗坏血酸，搅拌，用磁铁分离后得到黑色沉淀，用无水乙醇洗涤后得到Au@Fe3O4复合物。 8.根据权利要求7所述的新型冠状病毒2019-nCoV的电化学检测方法，其特征在于，所述的金纳米粒子负载Fe3O4纳米复合物的制备方法包含以下参数：所述聚乙二醇400、柠檬酸三钠、氯金酸、抗坏血酸的在超纯水中的浓度分别为0.10～0.25mg/mL、1～5mg/mL、2～6mg/mL、1～6mg/mL。 9.根据权利要求4所述的新型冠状病毒2019-nCoV的电化学检测方法，其特征在于，所述的金纳米粒子/磺酸化杯[8]芳烃/还原氧化石墨烯/电信号物质复合物的制备方法为：将4-磺酸杯[8]芳烃水合物SCX8、氧化石墨烯RGO分散到去离子水中，超声后调节pH值为7.0～12.0，回流反应后，离心，弃去上清液，固体用去离子水洗涤3～4次，得到还原的氧化石墨烯-SCX8复合物RGO-SCX8；将RGO-SCX8复合物分散于去离子水中，超声分散均匀后加入HAuCl4，搅拌、离心分离后弃去上清液，固体用去离子水洗涤，得到Au@RGO-SCX8复合物；把Au@RGO-SCX8复合物超声分散于去离子水中，然后加入电信号物质，搅拌，离心分离得到沉淀，用去离子水洗涤沉淀，最后得到Au@RGO-SCX8-电信号物质复合物。 10.根据权利要求9所述的新型冠状病毒2019-nCoV的电化学检测方法，其特征在于，所述的金纳米粒子/磺酸化杯[8]芳烃/还原氧化石墨烯/电信号物质复合物的制备方法包含以下参数：所述SCX8和氧化石墨在去离子水中的质量浓度均为0.1％～0.5％；HAuCl4在RGO-SCX8复合物RGO-SCX8分散液中的质量浓度为1％～5％；所述电信号物质为能被SCX8或其他大环超分子识别的电活性物质，每1mL Au@RGO-SCX8复合物分散液中添加0.2～1mg电信号物质；电信号物质为甲苯胺蓝、亚甲基蓝或二茂铁择一。 11.根据权利要求4所述的新型冠状病毒2019-nCoV的电化学检测方法，其特征在于，该检测方法包括电化学传感器的构建，其步骤为：将Au@Fe3O4复合物超声分散在缓冲液Ⅰ中，并加入捕获探针，在4℃的条件下放置5～20小时，磁铁分离；然后将固体加入缓冲液Ⅰ和己硫醇，己硫醇用来封闭非特异性位点，室温放置10～40min后，用磁铁分离，在分离后固体中加入缓冲液Ⅱ和目标RNA；室温下放置1～2小时后磁铁分离，在分离的固体中依次加入信号探针、辅助探针和Au@RGO-SCX8-电信号物质复合物分散液，室温下放置1～2小时后磁铁分离，将固体分散在磷酸缓冲液中，取分散液滴于丝网印刷电极表面，并在电化学工作站上用示差脉冲伏安法、循环伏安法或交流伏安法确定目标RNA的浓度和峰电流的关系，并获得电流强度与RNA浓度的标准曲线，进而完成电化学传感器的构建。 12.根据权利要求11所述的新型冠状病毒2019-nCoV的电化学检测方法，其特征在于，所述的电化学传感器的构建步骤具体为：将Au@Fe3O4复合物超声分散在缓冲液Ⅰ中，Au@Fe3O4复合物在缓冲液Ⅰ中的浓度为0.5～3mg/mL，并加入捕获探针，捕获探针在缓冲液Ⅰ中浓度为0.5～10μmol/L，在4℃的条件下放置5～20小时，磁铁分离；然后将固体加入缓冲液Ⅰ和己硫醇，固体在缓冲液Ⅰ中的浓度为0.5～3mg/mL，己硫醇在缓冲液Ⅰ中浓度为1～5mmol/L，己硫醇用来封闭非特异性位点，室温放置10～40min后，用磁铁分离，在分离后固体中加入缓冲液Ⅱ和浓度范围在10-18～10-9mol/L的目标RNA，分离后固体在缓冲液Ⅱ中的浓度是0.5～5mg/mL；室温下放置1～2小时后磁铁分离，在分离的固体中依次加入信号探针、辅助探针和Au@RGO-SCX8-电信号物质复合物分散液，室温下放置1～2小时后磁铁分离，将固体分散在磷酸缓冲液中，取分散液滴于丝网印刷电极表面，并在电化学工作站上用示差脉冲伏安法、循环伏安法或交流伏安法确定目标RNA的浓度和峰电流的关系，并获得电流强度与RNA浓度的标准曲线，进而完成电化学传感器的构建。 13.根据权利要求11或12所述的新型冠状病毒2019-nCoV的电化学检测方法，其特征在于，所述的电化学传感器的构建包含以下参数：其中所述信号探针和辅助探针的初始浓度均为10～20μmol/L，每1mg分离的固体中各添加100～150μL的信号探针和辅助探针；Au@RGO-SCX8-电信号物质复合物分散液的浓度为1～5mg/mL，每1mg分离的固体中添加1～1.5mL的Au@RGO-SCX8-电信号物质复合物分散液，探针用超纯水稀释；所述每0.1mg固体添加2-10μL浓度范围在10-18～10-9mol/L的目标RNA；所述缓冲液Ⅰ为含有10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA、300mmol/L NaCl、1mmol/LMgCl2的溶液；缓冲液Ⅱ为含有10mmol/L Tris-HCl、1mmol/LEDTA、300mmol/L NaCl、1mmol/LTCEP的溶液；所述磷酸缓冲液pH为7.2。 14.根据权利要求11或12所述的新型冠状病毒2019-nCoV的电化学检测方法，其特征在于，所述的检测方法为，使用该标准曲线计算待测样品中新型冠状病毒2019-nCoV中RNA的浓度，并根据该结果来评价待检样本中是否存在2019-nCoV，从而判断是否被病毒感染。 15.根据权利要求9所述的新型冠状病毒2019-nCoV的电化学检测方法，其特征在于，所述的金纳米粒子/磺酸化杯[8]芳烃/还原氧化石墨烯/电信号物质复合物的制备方法中除4-磺酸杯[8]芳烃水合物SCX8之外，替代物质为：杯[6]芳烃、环糊精、柱芳烃，即能和信号分子形成主客体包合物的大环超分子。
所属类别：	发明专利