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原文传递一组食管癌检测标志物及其在制备食管癌筛查试剂盒中的应用

专利名称：	一组食管癌检测标志物及其在制备食管癌筛查试剂盒中的应用
摘要：	本发明属于分子生物学和肿瘤学领域，具体涉及一组食管癌检测标志物及其在制备食管癌筛查试剂盒中的应用。其中，食管癌检测标志物为能够特异性检测CA19‑9、CYFRA21‑1、CA125、FBXW7和FAT1或该组基因表达产物的试剂；食管癌早期诊断试剂盒为液相蛋白芯片试剂盒。本申请首次将CA19‑9单克隆抗体、CYFRA21‑1单克隆抗体、CA125单克隆抗体、FBXW7单克隆抗体和FAT1单克隆抗体这一组合作为食管癌标志物，并用于制备对早期食管癌具有较高检测灵敏度和特异度的液相蛋白芯片，本发明液相蛋白芯片对食管癌的检测灵敏度为93.5%，特异度为73.9%。
专利类型：	发明专利
申请人：	郑州大学第一附属医院
发明人：	王立东;杨苗苗;孟超龙;宋昕;赵学科;范宗民;王苒;李贝;韩雪娜;靳艳
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T22:00:00+0805
申请号：	CN202010124532.1
公开号：	CN111190013A
代理机构：	郑州翊博专利代理事务所(普通合伙)
代理人：	付红莉
分类号：	G01N33/58;G01N33/577;G01N33/574;G01N33/543;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/58;G01N33/577;G01N33/574;G01N33/543
申请人地址：	450052 河南省郑州市大学路40号郑州大学第一附属医院省部共建食管癌防治国家重点实验
主权项：	1.能够特异性检测CA19-9、CYFRA21-1、CA125、FBXW7和FAT1或该组基因表达产物的试剂在食管癌早期诊断试剂盒中的应用。 2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为液相蛋白芯片试剂盒。 3.食管癌早期诊断用多标志物液相蛋白芯片试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括混合微粒悬液，所述微粒分别由五种食管癌标志物抗体与嵌入了量子点的胶体金包被原微粒偶联而成；所述五种食管癌标志物抗体为CA19-9单克隆抗体、CYFRA21-1单克隆抗体、CA125单克隆抗体、FBXW7单克隆抗体和FAT1单克隆抗体。 4.根据权利要求3所述的液相蛋白芯片试剂盒，其特征在于，所述混合微粒悬液通过下述方法制备：（1）制备胶体金包被原微粒，然后将胶体金包被原微粒分成5份，在各份胶体金包被原微粒表面分别嵌入激发波长相同但发射波长互不相同的量子点，得到5种嵌入了不同量子点的胶体金包被原微粒；（2）制备单克隆抗体：分别以CA19-9、CYFRA21-1、CA125、FBXW7和FAT1的重组蛋白作为抗原，分别制备出CA19-9单克隆抗体、CYFRA21-1单克隆抗体、CA125单克隆抗体、FBXW7单克隆抗体和FAT1单克隆抗体；（3）制备蛋白芯片：将步骤（2）制的5种单克隆抗体分别与胶体金包被原微粒偶联，分别制得CA19-9微粒溶液、CYFRA21-1微粒溶液、CA125微粒溶液、FBXW7微粒溶液和FAT1微粒溶液；取等量的CA19-9微粒溶液、CYFRA21-1微粒溶液、CA125微粒溶液、FBXW7微粒溶液和FAT1微粒溶液混合均匀，得到混合微粒悬液。 5.根据权利要求4所述的液相蛋白芯片试剂盒，其特征在于，所述步骤（1）包括如下操作过程：制备胶体金；利用胶体金包被原微粒：在离心管中加入0.05g原微粒和3g步骤制得的胶体金，充分振荡混匀后离心，弃去上层液体，沉淀用蒸馏水和无水乙醇反复洗涤后，在室温下干燥后获得胶体金包被的原微粒；将量子点嵌入到胶体金包被的原微粒表面：取玻璃试管，分别加入2mL浓度为300ppb的量子点氯仿溶液和0.01g步骤制得的胶体金包被原微粒，充分振荡后于通风橱中待氯仿挥发完全后，将剩下的微粒用无水乙醇反复洗涤，在室温下干燥后获得在嵌入了量子点的胶体金包被微粒。 6.根据权利要求5所述的液相蛋白芯片试剂盒，其特征在于，所述胶体金的制备过程为：将氯金酸配置成0.01wt％的水溶液，取100mL置于250mL容量的烧杯中，加热至沸腾后，保持沸腾的状态下加入80g柠檬酸钠，当氯金酸水溶液的颜色为稳定的红色后停止加热，待红色水溶液冷却至室温后，用蒸馏水恢复至原体积，即得胶体金。 7.根据权利要求4或6所述的液相蛋白芯片试剂盒，其特征在于，步骤（3）中各微粒溶液的制备过程如下： .对溶于磷酸缓冲液中的CA19-9单克隆抗体、CYFRA21-1单克隆抗体、CA125单克隆抗体、FBXW7单克隆抗体和FAT1单克隆抗体，分别进行下述处理：在电磁搅拌仪的持续搅拌下，加入磷酸缓冲液，稀释成浓度为30μg/mL的溶液； .向步骤中稀释后的溶液中再依次加入20ml1％的吐温80、0.01g步骤中制得的嵌入了量子点的胶体金包被原微粒，持续搅拌15min后，加入30ml5％的BSA溶液封闭微粒上没有偶联完的位点，待封闭完成后，对溶液进行离心，取沉淀用PBS缓冲液反复洗涤后，分别得到偶联了CA19-9单克隆抗体的CA19-9微粒、偶联了CYFRA21-1单克隆抗体的CYFRA21-1微粒、偶联了CA125单克隆抗体的CA125微粒和偶联了FBXW7单克隆抗体的FBXW7微粒、偶联了FAT1单克隆抗体的FAT1微粒，各号微粒保存在100ml的PBS缓冲液中，微粒浓度均为1μg/mL。 8.根据权利要求3或4或5或7所述的蛋白芯片，其特征在于，所述原微粒由聚苯乙烯与丙烯酸松香脂按照质量比2:1聚合而成。
所属类别：	发明专利