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原文传递一种测定大鼠淋巴细胞中烟碱乙酰胆碱受体表达量的方法

专利名称：	一种测定大鼠淋巴细胞中烟碱乙酰胆碱受体表达量的方法
摘要：	本发明属于生命科学研究领域，具体涉及一种检测大鼠外周血淋巴细胞中烟碱乙酰胆碱受体（nicotine acetylcholine receptors,nAChRs）表达量的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：1）大鼠外周血淋巴细胞的分离；2）细胞总蛋白的获取、浓度测定及样品制备；3）蛋白免疫印迹（western blot,WB）实验检测淋巴细胞中nAChRs的表达量。本发明通过对外周血淋巴细胞中蛋白的测定能够实现实时动物外周血中蛋白表达的检测，对烟碱成瘾生物标志物的研究具有重要意义。
专利类型：	发明专利
申请人：	安徽大学
发明人：	程皖燕;付亚宁;陈欢;王安;刘勇;侯宏卫;胡清源
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
申请号：	CN202010232528.7
公开号：	CN111208306A
代理机构：	郑州中民专利代理有限公司
代理人：	黄宇亭
分类号：	G01N33/68;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/68
申请人地址：	230601 安徽省合肥市经济技术开发区九龙路111号
主权项：	1.一种检测大鼠外周血淋巴细胞中烟碱乙酰胆碱受体（nicotine acetylcholinereceptors, nAChRs）表达量的方法，其特征在于：该方法包括： 1）大鼠外周血淋巴细胞的分离； 2）细胞总蛋白的获取、浓度测定及样品制备； 3）蛋白免疫印迹（western blot, WB）实验检测淋巴细胞中nAChRs的表达量。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤 1）的具体步骤如下：获得大鼠外周血5 mL于抗凝管中，在2 h内22℃下1500 r/min离心15 min获得云雾白细胞层，用2 mL无菌PBS稀释为白细胞稀释液；向15 mL离心管中依次小心加入与白细胞稀释液等体积的1.081 g/mL细胞分离液、2mL白细胞稀释液和2 mL 无菌PBS，加入过程中保证白细胞稀释液完全平铺在1.081 g/mL细胞分离液上，22℃下2000 r/min离心20 min，用移液枪吸取淋巴细胞层，向得到的淋巴细胞中加入6~8 mL无菌PBS重悬细胞，22℃下1150 r/min离心10 min以洗脱淋巴细胞中掺杂的Percoll溶液，重复洗涤2~3次；向细胞沉淀中加入2 mL红细胞裂解液于冰上裂解，裂解结束后，加入8 mL无菌PBS终止裂解，22℃下1150 r/min离心10 min，弃红色上清，重复2次，得到淋巴细胞。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述细胞分离液的制备方法如下：按照9:1的体积比，向18 mL Percoll原液中加入2mL灭菌的1.5 mol/L氯化钠溶液配制成20 mL Percoll稀释液；取5.785 mL Percoll稀释液加入4.215 mL 0.9%的无菌生理盐水配制成1.081 g/mL的细胞分离液。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤 2）的具体步骤如下：向权利要求2中得到的淋巴细胞中加入裂解液100-200 μL，使用移液枪反复吸取打出溶液，直到裂解液中无明显沉淀后，放置冰上静置裂解30 min，然后在4℃下10000 r/min离心7 min，吸取上清即为细胞总蛋白提取液；测定蛋白浓度；蛋白浓度<1000 μg/mL时加入1/4体积的上样缓冲液，蛋白浓度≥1000μg/mL时加入1/3体积的上样缓冲液，煮沸5 min进行蛋白变性。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤 3）的具体步骤如下：将权利要求4中的变性蛋白以10 μL直接上样到电泳胶的加样孔中，在冰浴中进行电泳，将初始电泳电压调至80 V，待上样缓冲液中的示踪染料至浓缩胶与分离胶交界处时，将电泳电压调至90 V；当上述示踪染料到达胶的底端附近时即可停止电泳，切下待测蛋白分子量区域使用PVDF膜进行转膜，转膜电压为100 V，转膜后将印迹膜放入无蛋白封闭缓冲液中，于摇床上常温封闭3 h，然后用洗膜液洗膜3次，加入待测蛋白的一抗，4℃孵育过夜，洗膜后加入二抗，4℃孵育3 h后洗膜，然后进行显影。 6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：抗体孵育后使用TBST缓冲液洗膜5 min×6次，采用pg级显影液进行显影。
所属类别：	发明专利