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原文传递一种基于HS-SPME和GC-MS检测枯草芽孢杆菌Y13挥发性抑菌物质的方法

专利名称：	一种基于HS-SPME和GC-MS检测枯草芽孢杆菌Y13挥发性抑菌物质的方法
摘要：	本发明属于测试领域，具体公开了一种基于顶空固相微萃取技术和气相色谱‑质谱检测枯草芽孢杆菌Y13挥发性抑菌物质的方法。该方法利用顶空固相微萃取技术收集枯草芽孢杆菌Y13的挥发性物质，使用GC‑MS对挥发物的成分及量进行检测。能够全面、准确的测定枯草芽孢杆菌Y13挥发物的成分及含量；并且在常温范围内即可完成，避免了分析过程中产生新的化合物；本发明的顶空固相微萃取技术工作条件，能有效富集Y13挥发物各成分；GC‑MS检测采用分段升温，可以使挥发物成分得到有效分离，相应的质谱参数可以实现快速准确地鉴定出挥发物成分；并且以果生炭疽菌作为指示菌，鉴定出了枯草芽孢杆菌Y13挥发物具强抑菌效果的有效成分。
专利类型：	发明专利
申请人：	海南科大林业有限公司
发明人：	倪源;周国英;徐睿;冯福山
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T20:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T10:00:00+0805
申请号：	CN201911328221.0
公开号：	CN110988184A
代理机构：	长沙市融智专利事务所(普通合伙)
代理人：	魏娟
分类号：	G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N1/22;G;G01;G01N;G01N30;G01N1;G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N1/22
申请人地址：	571900 海南省海口市澄迈县金江镇环城西路瑞佳花园301室
主权项：	1.一种基于顶空固相微萃取技术和气相色谱-质谱检测枯草芽孢杆菌Y13挥发性抑菌物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)：顶空固相微萃取采用二乙烯苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷的微萃取头固相萃取枯草芽孢杆菌Y13发酵的挥发成分；步骤(2)：GC-MS检测步骤(1)处理得到的微萃取头进行GC-MS检测； GC-MS检测过程中，气相色谱条件为：采用HP-5石英毛细管色谱柱，进样口温度225～235℃，载气为氦气，色谱柱初始温度45～55℃，保持1.5～2.5min，柱流量0.9～1.1mL/min，分流进样，分流比为9～10∶1，以5.5～6.5℃/min升温速率至175～185℃，保持0.9～1.1min，在以9.5～10.5℃/min升温速率至245～255℃，保持2.9～3.1min；质谱条件为：电子轰击离子源(EI)，离子源温度为225～235℃，GC-MS接口温度225～235℃，四极杆温度145～155℃，电子能量65～75eV，质量扫描范围为30～450m/z。 2.如权利要求1所述的基于顶空固相微萃取技术和气相色谱-质谱检测枯草芽孢杆菌Y13挥发性抑菌物质的方法，其特征在于，GC-MS检测过程中，气相色谱条件为：采用HP-5石英毛细管色谱柱，进样口温度230℃，载气为氦气，色谱柱初始温度50℃，保持2min，柱流量1mL/min，分流进样，分流比为10∶1，以6℃/min升温速率至180℃，保持1min，在以10℃/min升温速率至250℃，保持3min；质谱条件为：电子轰击离子源(EI)，离子源温度为230℃，GC-MS接口温度230℃，四极杆温度150℃，电子能量70eV，质量扫描范围为30～450m/z。 3.如权利要求1所述的基于顶空固相微萃取技术和气相色谱-质谱检测枯草芽孢杆菌Y13挥发性抑菌物质的方法，其特征在于，步骤(1)中，将枯草芽孢杆菌Y13菌液与NB液体培养基混合，然后置于顶空进样瓶中，将顶空瓶置于26～30℃、130～150r/min恒温摇床中培养；顶空瓶平衡后再采用HS-SPME技术，向顶空瓶中插入活化后的微萃取头，固相萃取顶空瓶中收集的挥发成分。 4.如权利要求3所述的基于顶空固相微萃取技术和气相色谱-质谱检测枯草芽孢杆菌Y13挥发性抑菌物质的方法，其特征在于，枯草芽孢杆菌Y13菌液的浓度为0.8～1.2×109CFU/mL；枯草芽孢杆菌Y13菌液、NB液体培养基的体积比为1:15～25。 5.如权利要求1所述的基于顶空固相微萃取技术和气相色谱-质谱检测枯草芽孢杆菌Y13挥发性抑菌物质的方法，其特征在于，平衡过程的温度为35～45℃，平衡时间为1h以上。 6.如权利要求1所述的基于顶空固相微萃取技术和气相色谱-质谱检测枯草芽孢杆菌Y13挥发性抑菌物质的方法，其特征在于，微萃取头的活化的温度为220～240℃；时间为8～12min。 7.如权利要求1所述的基于顶空固相微萃取技术和气相色谱-质谱检测枯草芽孢杆菌Y13挥发性抑菌物质的方法，其特征在于，固相萃取的时间为15～25min。 8.如权利要求1所述的基于顶空固相微萃取技术和气相色谱-质谱检测枯草芽孢杆菌Y13挥发性抑菌物质的方法，其特征在于，HP-5石英毛细管色谱柱为30.0m×0.25mm×0.25μm的色谱柱；将固相萃取后的微萃取头插入气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)进样口解析2～3min，后进行GC-MS分析。 9.如权利要求1～8任一项所述的基于顶空固相微萃取技术和气相色谱-质谱检测枯草芽孢杆菌Y13挥发性抑菌物质的方法，其特征在于，通过气相色谱-质谱鉴定出挥发物成分；并且以果生炭疽菌作为指示菌，鉴定枯草芽孢杆菌Y13挥发物的抑菌作用。 10.如权利要求9所述的基于顶空固相微萃取技术和气相色谱-质谱检测枯草芽孢杆菌Y13挥发性抑菌物质的方法，其特征在于，鉴定枯草芽孢杆菌Y13挥发物的抑菌作用的步骤为：制备PDA培养基平板并在平板中央接入新鲜的果生炭疽菌菌饼，再分别在培养皿皿盖中央放置无菌干燥的滤纸片，用移液枪分别往滤纸片上滴加不同体积的挥发物化合物纯品，然后将培养皿用双层封口膜封住，于28℃恒温培养箱中倒置培养，每个纯品均设5μL、10μL、15μL、20μL四种体积梯度，以滤纸片上滴加无菌水为对照，待对照组病原真菌菌落直径长至超过培养皿直径的3/4时，测量病原真菌的菌落直径，每个处理设3次重复。
所属类别：	发明专利