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原文传递一种基于二氧化硅的超分辨成像探针的制备方法及应用

专利名称：	一种基于二氧化硅的超分辨成像探针的制备方法及应用
摘要：	本发明公开了一种基于二氧化硅的超分辨成像探针及其制备方法和应用，该超分辨成像探针为连接了Alexa Fluor 647染料的二氧化硅纳米粒子，并且其表面偶联了HER2（人表皮生长因子受体‑2）核酸适配体；该探针能靶向识别过表达HER2的细胞外泌体，即对过表达HER2的细胞外泌体进行荧光标记；利用超高分辨率显微镜即可对特异性识别该探针的细胞外泌体进行超分辨光学成像；该探针粒径均一，尺寸较小，定位精度高，闪烁性能优良，适用于基于单分子定位法的超高分辨率光学成像；本发明实现了超分辨成像探针对于外泌体的标记，利用单分子定位显微镜，通过双通道共定位的方式，能够实现对细胞外泌体的准确标记。
专利类型：	发明专利
申请人：	东南大学
发明人：	宗慎飞;袁江南;王著元;崔一平
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T21:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T21:00:00+0805
申请号：	CN201911332033.5
公开号：	CN111044496A
代理机构：	南京众联专利代理有限公司
代理人：	薛雨妍
分类号：	G01N21/64;G;G01;G01N;G01N21;G01N21/64
申请人地址：	210096 江苏省南京市玄武区四牌楼2号
主权项：	1.一种基于二氧化硅的超分辨成像探针及其制备方法，其特征在于，具体步骤如下：在L-精氨酸/环己烷/水的微乳液体系中，由 TEOS（正硅酸乙酯）水解反应制备二氧化硅纳米小球，向二氧化硅纳米球中掺入Alexa Fluor 647 NHS ester（琥珀酰亚胺酯）后，加入偶联剂以及HER2核酸适配体溶液，在掺了染料的二氧化硅纳米球表面偶联HER2适配体，即可得到超分辨成像探针。 2.根据权利要求1所述一种基于二氧化硅的超分辨成像探针及其制备方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）将L-精氨酸和水充分混合，向溶液中加入环己烷后水浴加热，再向溶液中加入TEOS后水浴加热并磁力搅拌，待反应结束，得到直径15-20nm的二氧化硅纳米小球溶液；（2）将二氧化硅小球溶液离心提纯至无水乙醇中，加入APTMS（3-氨基丙基三甲氧基硅烷），摇晃反应，得到修饰了氨基的二氧化硅小球溶液；向氨基化后的二氧化硅小球溶液中加入Alexa Fluor 647，摇床反应，待反应结束后，离心提纯即得到连接上染料的二氧化硅纳米球；（3）在步骤（2）所得的掺染料的二氧化硅纳米球中依次加入偶联剂溶液以及HER2适配体溶液，并放于摇床摇晃反应，离心提纯，即可得超分辨成像探针。 3.根据权利要求2所述的一种基于二氧化硅的超分辨成像探针及其制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，L-精氨酸与水的质量比为1.32：1000，水、环己烷和TEOS的体积比为100：6.52：7.68-7.97。 4.根据权利要求2所述的一种基于二氧化硅的超分辨成像探针及其制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，水浴加热温度为60摄氏度，反应时间为20-24小时。 5.根据权利要求2所述的一种基于二氧化硅的超分辨成像探针及其制备方法，其特征在于：所述步骤（2）得到的二氧化硅小球溶液中，二氧化硅的总浓度为15-20 mg/mL；加入的APTMS与无水乙醇的体积比为4-7:1000。 6.根据权利要求2所述的一种可靶向外泌体的超分辨成像探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，二氧化硅和Alexa Fluor 647 NHS ester的质量比为10000:1-2.5。 7.根据权利要求2所述的一种基于二氧化硅的超分辨成像探针及其制备方法，其特征在于：所述步骤（2）的摇床摇晃反应时间均为8-16小时；所述步骤（2）中，离心时转速为16000-18000 round/min，离心时间为25-30分钟。 8.根据权利要求2所述的一种基于二氧化硅的超分辨成像探针及其制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的偶联剂为戊二醛，戊二醛的终浓度为0.1-1%。 9.根据权利要求2所述的一种基于二氧化硅的超分辨成像探针及其制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中二氧化硅纳米球溶液与HER2适配体的体积比为100:2-7，所述HER2适配体的浓度是10 μM；所述步骤（3）床摇晃反应时间为时。 10.根据权利要求1-8任意一项所述的制备方法制得的超分辨成像探针在外泌体超分辨成像中的应用，其特征在于：具体步骤如下： 1）取外泌体稀释后加入DiI（细胞膜红色荧光探针）染料，反应结束后得到连接上了DiI染料的外泌体； 2）将经过步骤1）处理后的外泌体用超滤管离心去除多余DiI染料杂质； 3）将经过步骤2）处理后的外泌体用PEI（聚醚酰亚胺）固定； 4）在经过步骤3）处理后的外泌体中加入BSA（牛血清白蛋白）溶液，封闭外泌体上的非特异性位点； 5）在经过步骤4）处理后的外泌体中加入已经制备好的基于二氧化硅的超分辨成像探针，并加入包含巯基乙醇、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶及葡萄糖的成像缓冲液； 6）将加入了成像缓冲液的样品放于单分子定位显微镜下进行双通道共定位成像，激发光波长分别为561nm和642 nm，两个通道下同时进行超分辨光学成像。
所属类别：	发明专利