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原文传递一种测定烟稻轮作田土壤中二氯喹啉酸的方法

专利名称：	一种测定烟稻轮作田土壤中二氯喹啉酸的方法
摘要：	本发明公开了一种时间分辨荧光免疫分析法测定烟稻轮作田土壤中二氯喹啉酸的方法，其以二氯喹啉酸包被抗原、二氯喹啉酸单克隆抗体、Eu3+标记抗体为检测体系，经时间分辨荧光测定建立荧光强度与二氯喹啉酸浓度对应的标准曲线，然后利用所得标准曲线计算获得土壤样品中二氯喹啉酸的含量。本发明方法具有灵敏度高、重现性好、回收率高、有机溶剂用量少、成本低等特点，能够满足烟稻轮作田土壤中二氯喹啉酸的快速、灵敏检测。
专利类型：	发明专利
申请人：	福建省烟草公司三明市公司
发明人：	林建麒;黄一兰;林智慧;梁颁捷;姜占省;叶建如;方松;杨林潇;孔凡玉
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T10:00:00+0805
申请号：	CN201911349441.1
公开号：	CN110987892A
代理机构：	福州元创专利商标代理有限公司
代理人：	修斯文;蔡学俊
分类号：	G01N21/64;G01N1/34;G01N33/532;G;G01;G01N;G01N21;G01N1;G01N33;G01N21/64;G01N1/34;G01N33/532
申请人地址：	365000 福建省三明市梅列区崇桂新村100幢
主权项：	1.一种测定烟稻轮作田土壤中二氯喹啉酸的方法，其特征在于：包括以下步骤： 1）将二氯喹啉酸标准品用磷酸盐缓冲液溶解，得到具有系列浓度的二氯喹啉酸标准溶液； 2）将二氯喹啉酸溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌反应15min，再加入二环已基碳二亚胺，室温下反应过夜，离心后取上清液，缓慢加入到卵清蛋白中，磁力搅拌下反应4h，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2次，然后用磷酸盐缓冲液溶液透析3天，得到二氯喹啉酸包被抗原，于-20℃保存； 3）将山羊抗鼠抗体和异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕分别用碳酸盐缓冲液溶解后，将两者混合，4℃下搅拌24小时后装入透析袋，使用含0.01%氯化钠的Tris-HCl缓冲液透析72h后获得Eu3+标记抗体，向其中加入等体积的甘油和0.1wt%的牛血清蛋白，-20℃保存； 4）将步骤2）制得的二氯喹啉酸包被抗原溶解在碳酸盐缓冲液中，加入微孔板中，孵育2小时；用含0.05vol%Tween-20的磷酸盐缓冲液清洗去除未结合的包被抗原，然后加入溶解有1wt%卵清蛋白的Tris-HCl缓冲液，孵育0.5小时以封闭微孔，再用含0.05vol%Tween-20的磷酸盐缓冲液清洗去除过量的卵清蛋白； 5）在步骤4）所得体系中分别加入系列浓度的二氯喹啉酸标准溶液后，再加入经含甲醇的磷酸盐缓冲液稀释的二氯喹啉酸单克隆抗体，孵育0.5小时，用含0.05 vol%Tween-20的磷酸盐缓冲液清洗微孔板后加入步骤3）制备好的Eu3+标记抗体，孵育1小时，再用含0.05vol%Tween-20的磷酸盐缓冲液清洗微孔板，加入荧光增强液，机械振荡10分钟； 6）使用时间分辨荧光测定仪分别测定不含二氯喹啉酸标准溶液的空白反应体系及步骤5）含二氯喹啉酸标准溶液的反应体系，得到其相应荧光强度F0、F，然后以二氯喹啉酸浓度为横坐标，F与F0的百分比F/F0作为纵坐标绘制标准曲线； 7）将来源于烟稻轮作田的土壤按料液比1:5 g/mL加入甲醇/磷酸盐缓冲液混合溶液中，超声提取10min，得到样品溶液； 8）将所得样品溶液按步骤5）所述步骤进行处理后，使用时间分辨荧光测定仪测定其荧光强度，再利用所得标准曲线计算获得样品中二氯喹啉酸的含量。 2.根据权利要求1所述的测定烟稻轮作田土壤中二氯喹啉酸的方法，其特征在于：步骤1）-4）中所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH=7.4；所述碳酸盐缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH=9.6；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH=7.8。 3.根据权利要求1所述的测定烟稻轮作田土壤中二氯喹啉酸的方法，其特征在于：步骤2）中所用二氯喹啉酸、N-羟基琥珀酰亚胺与二环已基碳二亚胺的摩尔比为1:3:1.5。 4.根据权利要求1所述的测定烟稻轮作田土壤中二氯喹啉酸的方法，其特征在于：步骤3）中所用山羊抗鼠抗体与异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕的质量比5:2。 5. 根据权利要求1所述的测定烟稻轮作田土壤中二氯喹啉酸的方法，其特征在于：步骤5）中以所加入二氯喹啉酸标准溶液的体积为基准，二氯喹啉酸单克隆抗体的加入量为0.2 mg/L，Eu3+标记抗体的加入量为1.0mg/L；所用含甲醇的磷酸盐缓冲液的pH=7，其中磷酸盐浓度为0.01mol/L、甲醇含量为10vol%、Na+浓度为0.2mol/L。 6. 根据权利要求1所述的测定烟稻轮作田土壤中二氯喹啉酸的方法，其特征在于：步骤5）所述荧光增强液为含15μmol/L β-萘三氟丙酮和0.1 vol% Triton X-100的0.1mol/L双邻苯二甲酸钾缓冲液，其pH=3.2。 7.根据权利要求1所述的测定烟稻轮作田土壤中二氯喹啉酸的方法，其特征在于：步骤7）所述甲醇/磷酸盐缓冲液混合溶液中甲醇与磷酸盐缓冲液的体积比为1:1；所用磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH=7.4。 8.根据权利要求1所述的测定烟稻轮作田土壤中二氯喹啉酸的方法，其特征在于：检测时，时间分辨荧光测定仪的参数设置为激发波长340nm、发射波长615nm、延迟时间100μs、窗口时间400μs。
所属类别：	发明专利