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原文传递一种利用类器官检测溶瘤病毒有效性的方法

专利名称：	一种利用类器官检测溶瘤病毒有效性的方法
摘要：	本公开涉及一种利用类器官检测溶瘤病毒有效性的方法，该方法包括：a、将溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12‑96h，得到第一培养物，检测第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平；b、将溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12‑96h，得到第二培养物，检测第二培养物中溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤率；c、将溶瘤病毒、免疫细胞和肿瘤类器官混合培养2‑8h，得到第三培养物，检测第三培养物中的细胞因子水平并计算溶瘤病毒的细胞因子促表达能力，细胞因子包括白细胞介素‑2和/或γ‑干扰素；如果待测溶瘤病毒的复制水平、对肿瘤细胞的杀伤率和细胞因子促表达能力均高于参比溶瘤病毒，则指示待测溶瘤病毒的有效性高于参比溶瘤病毒。本公开的检测方法能较真实地检测溶瘤病毒的有效性。
专利类型：	发明专利
申请人：	浙江科途医学科技有限公司
发明人：	孙志坚;康平;李程
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T01:00:00+0805
申请号：	CN201911401145.1
公开号：	CN111089977A
代理机构：	北京英创嘉友知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	耿超
分类号：	G01N33/68;G01N33/569;C12Q1/70;C12N5/09;G;C;G01;C12;G01N;C12Q;C12N;G01N33;C12Q1;C12N5;G01N33/68;G01N33/569;C12Q1/70;C12N5/09
申请人地址：	313000 浙江省湖州市红丰路1366号6幢10楼1001
主权项：	1.一种利用类器官检测溶瘤病毒有效性的方法，其特征在于，该方法包括： a、将溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12-96h，得到第一培养物，检测所述第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平； b、将所述溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12-96h，得到第二培养物，检测所述第二培养物中溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤率； c、将所述溶瘤病毒、免疫细胞和肿瘤类器官混合培养2-8h，得到第三培养物，检测所述第三培养物中的细胞因子水平并计算所述溶瘤病毒的细胞因子促表达能力，所述细胞因子包括白细胞介素-2和/或γ-干扰素；如果待测溶瘤病毒的复制水平、对肿瘤细胞的杀伤率和细胞因子促表达能力均高于参比溶瘤病毒，则指示所述待测溶瘤病毒的有效性高于所述参比溶瘤病毒。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中还包括将肿瘤类器官进行第一预培养的步骤，然后再将第一预培养后的肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养；所述第一预培养包括：将肿瘤类器官与温敏性水凝胶、肿瘤类器官培养液混合，培养12-96h，其中，相对于5000-10000个肿瘤类器官中的肿瘤细胞，温敏性水凝胶的用量为500-1000μL，肿瘤类器官培养液的用量为2000-3000μL；将肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养时，溶瘤病毒的用量为0.01-1MOI；步骤b中还包括将肿瘤类器官进行第二预培养的步骤，然后再将第二预培养后的肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养；所述第二预培养包括：将肿瘤类器官与温敏性水凝胶、肿瘤类器官培养液混合，培养12-96h，其中，相对于300-1000个肿瘤类器官中的肿瘤细胞，温敏性水凝胶的用量为30-80μL，肿瘤类器官培养液的用量为100-150μL；将肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养时，溶瘤病毒的用量为0.01-1MOI；步骤c中，所述将溶瘤病毒、免疫细胞和肿瘤类器官混合培养，包括：c1、将含有免疫细胞和肿瘤类器官的细胞悬液接种在培养皿中，加入肿瘤类器官培养液培养2-8h，得到混合培养液，其中所述细胞悬液中免疫细胞和肿瘤细胞的浓度为0.1-1×107个/mL，免疫细胞：肿瘤类器官细胞＝(2-8)：1，相对于0.5-2mL所述细胞悬液，所述肿瘤类器官培养液的用量为2-3mL；c2、将所述混合培养液与溶瘤病毒混合培养3-5h，所述溶瘤病毒的用量为1-100MOI。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中，所述检测所述第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平，包括： a1、获取所述第一培养物中的溶瘤病毒，得到待测病毒； a2、将所述待测病毒与所述溶瘤病毒的宿主细胞混合培养12-96h，然后检测所述待测病毒在所述宿主细胞中的病毒滴度；其中，所述待测病毒在所述宿主细胞中的病毒滴度越高，所述第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平越高。 4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤a1中，所述获取所述第一培养物中的溶瘤病毒，得到待测病毒，包括：将所述第一培养物进行冻融处理2-8次，然后进行离心并收集上清液，得到待测病毒液，所述待测病毒液中含有所述待测病毒。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中，利用CCK8试剂盒检测所述第二培养物中溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤率；步骤c中，利用ELISA试剂盒检测所述第三培养物中的细胞因子水平。 6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中所述免疫细胞从患者外周血中分离得到。 7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤a、步骤b和步骤c中所述的混合培养在肿瘤类器官培养液中进行，所述肿瘤类器官培养液包括DMEM/F12培养基和生长因子；所述生长因子包括Glutamax、HEPES、Gastrin、nicotinamide、A83-01、Noggin、n-Acetylcysteine、青链霉素、EGF和BSA中的至少一种。 8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述生长因子中，所述Glutamax的浓度为0.5-2％、所述HEPES的浓度为5-15mM、所述Gastrin的浓度为5-15nM、所述nicotinamide的浓度为5-15mM、所述A83-01的浓度为250-600ng/mL、所述Noggin的浓度为50-150ng/mL、所述n-Acetylcysteine的浓度为0.5-2mM、所述青链霉素的浓度为50-150μg/mL、所述EGF的浓度为50-150ng/mL、所述BSA的浓度为1-5mg/mL。 9.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于，所述肿瘤类器官的制备方法包括：将肿瘤细胞、温敏性水凝胶和肿瘤类器官培养液混合并进行培养，每隔2-4天更换一次培养基，直至显微镜下观察到直径不小于0.5mm的肿瘤类器官。 10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，相对于20000个所述肿瘤细胞，所述温敏性水凝胶的用量为1500-2000μL，所述肿瘤类器官培养液的用量为2000-3000μL。
所属类别：	发明专利