专利名称: |
一种T4多聚核苷酸激酶的阴极光电化学检测模型及其应用 |
摘要: |
本发明涉及分析检测领域,尤其是涉及一种非标记、非固定的阴极光电化学检测T4多聚核苷酸激酶的检测模型,制备方法及其应用。所述检测模型的构建方法包括如下步骤:(1)Bi2O3纳米材料的制备、(2)Bi2O3/ITO电极的制备、(3)不同T4多聚核苷酸激酶浓度的生物反应液的制备、(4)光电流的测定、(5)线性模型构建;应用本检测模型来检测T4 PNK,无需生物分子固定、操作简便、成本低、选择性好、灵敏度高,且线性范围宽(5.0×10‑4~10U/mL)、检测限低(1.0×10‑4U/mL)、在实际应用中具有巨大的潜力。 |
专利类型: |
发明专利 |
国家地区组织代码: |
江苏;32 |
申请人: |
江南大学 |
发明人: |
王光丽;赵玲玲;董玉明;陈彦如;刘田利 |
专利状态: |
有效 |
申请日期: |
2021-12-15T00:00:00+0800 |
发布日期: |
2022-03-18T00:00:00+0800 |
申请号: |
CN202111536174.6 |
公开号: |
CN114199970A |
代理机构: |
无锡华源专利商标事务所(普通合伙) |
代理人: |
冯智文 |
分类号: |
G01N27/327;G01N1/28;G;G01;G01N;G01N27;G01N1;G01N27/327;G01N1/28 |
申请人地址: |
214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号 |
主权项: |
1.一种T4多聚核苷酸激酶的阴极光电化学检测模型,其特征在于,其构建方法包括如下步骤: (1)Bi2O3纳米材料的制备:制备Bi2O3纳米材料; (2)Bi2O3/ITO电极的制备:将Bi2O3纳米材料结合到ITO电极表面制得Bi2O3/ITO电极; (3)不同T4多聚核苷酸激酶浓度的生物反应液的制备: a磷酸化反应:将序列如SEQ ID NO:1的发夹DNA加入含有不同浓度T4多聚核苷酸激酶的缓冲液中进行磷酸化反应; b剪切反应:加入λ核酸外切酶进行剪切; c连接反应:加入序列如SEQ ID NO:2的锁式探针DNA,在DNA连接酶存在下进行连接反应; d滚环扩增反应:加入DNA聚合酶进行滚环扩增,获得不同T4多聚核苷酸激酶浓度的生物反应液; (4)光电流的测定:采用步骤(2)制备的Bi2O3/ITO电极测定步骤(3)中制备的不同T4多聚核苷酸激酶浓度的生物反应液的光电流值; (5)线性模型构建:根据步骤(4)测定的光电流值和不同T4多聚核苷酸激酶浓度之间的对应关系进行线性模型的构建。 2.根据权利要求1所述的阴极光电化学检测模型,其特征在于,所述步骤(1)中Bi2O3纳米材料的制备,包括以下步骤: 将可溶性铋盐溶解在去离子水中,然后加入柠檬酸三钠,尿素和聚乙烯吡咯烷酮,水热反应后干燥,获得Bi2O3纳米材料的粉末样品。 3.根据权利要求1所述的阴极光电化学检测模型,其特征在于,所述步骤(2)中Bi2O3/ITO电极的制备,包括以下步骤: 将步骤(1)获得的Bi2O3纳米材料分散在去离子水中,制成悬浊液;然后将所得悬浊液滴涂到ITO电极表面,干燥,制得Bi2O3/ITO电极。 4.根据权利要求1所述的阴极光电化学检测模型,其特征在于,所述步骤(4)中光电流的测定,包括以下步骤: 在步骤(3)获得的不同T4多聚核苷酸激酶浓度的生物反应液中加入银离子溶液,并在室温下孵育;之后加入铁氰化钾溶液,继续反应;随后将步骤(2)所得Bi2O3/ITO电极浸入到上述反应溶液并反应;最后,将反应后的Bi2O3/ITO电极取出、用缓冲溶液洗涤后在光电化学测试系统上进行光电流的测定,得到不同已知浓度的T4多聚核苷酸激酶的光电流值。 5.根据权利要求1所述的阴极光电化学检测模型,其特征在于,所述步骤(5)中线性模型构建,包括以下步骤: 通过步骤(4)所得的不同已知T4多聚核苷酸激酶浓度的光电流值I,和T4多聚核苷酸激酶浓度为0的样品所得的光电流值I0,计算得到不同浓度相应的光电流差值I-I0;然后利用不同已知T4多聚核苷酸激酶浓度的对数值和相应光电流的差值构建线性模型。 6.根据权利要求1所述的阴极光电化学检测模型,其特征在于,所述步骤(3)中的a磷酸化反应,包括以下步骤: 将序列为SEQ ID NO:1的发夹DNA,与不同浓度的T4多聚核苷酸激酶、三磷酸腺苷、T4多聚核苷酸激酶反应缓冲液混合,孵育以实现磷酸化反应。 7.根据权利要求1所述的阴极光电化学检测模型,其特征在于,所述步骤(3)中的b剪切反应,包括以下步骤: 在a磷酸化反应的反应产物中加入λ核酸外切酶与相应的λ核酸外切酶反应缓冲液,继续孵育反应实现对磷酸化之后的发夹DNA的剪切反应。 8.根据权利要求1所述的阴极光电化学检测模型,其特征在于,所述步骤(3)中的d滚环扩增反应,包括以下步骤: 在c连接反应的反应液中加入T4 DNA连接酶与T4 DNA连接酶反应缓冲液进行连接反应;反应完成后加入phi 29DNA聚合酶和phi 29DNA聚合酶反应缓冲液以及dNTPs,室温下反应以实现滚环扩增反应,最后升温终止滚环扩增反应。 9.一种权利要求1-8任一项所述的T4多聚核苷酸激酶的阴极光电化学检测模型的应用,其特征在于,应用于定量测定细胞裂解液中T4多核苷酸激酶。 10.一种T4多聚核苷酸激酶的检测试剂盒,其特征在于,包含权利要求1-8任一项所述的T4多聚核苷酸激酶的阴极光电化学检测模型。 |
所属类别: |
发明专利 |