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原文传递一种检测植物材料中植物内源小肽激素的纯化富集方法

专利名称：	一种检测植物材料中植物内源小肽激素的纯化富集方法
摘要：	本发明公开了一种基于反相‑离子交换混合模式固相萃取的植物内源小肽的纯化方法。该方法将植物内源小肽经过溶剂提取，提取液与吸附材料作用，植物内源小肽吸附于材料表面，经淋洗去除基质杂质后，再通过洗脱将吸附在固相萃取材料上的植物小肽洗脱而得。该方法简单、快速、易操作，所用分离材料为商品化固相萃取柱，易获取。整个处理流程容易学习和上手，可供相关科研人员方便的使用，在植物激素调控、生物标志物筛选等领域具有广泛的应用前景。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	中国科学院遗传与发育生物学研究所
发明人：	褚金芳;闫吉军;辛培勇;程淑静
专利状态：	有效
申请日期：	2021-05-28T00:00:00+0800
发布日期：	2022-11-29T00:00:00+0800
申请号：	CN202110590146.6
公开号：	CN115407002A
代理机构：	北京纪凯知识产权代理有限公司
代理人：	关畅
分类号：	G01N30/06;G01N30/02;G;G01;G01N;G01N30;G01N30/06;G01N30/02
申请人地址：	100101 北京市朝阳区北辰西路1号院2号
主权项：	1.一种纯化植物内源小肽的方法，包括： 1)向植物原料中加入提取溶剂，混匀后静置提取，去除残渣后，收集提取液进行如下处理a；所述处理a为上样于1种装填有混合型离子交换与反相保留吸附剂的Oasis固相萃取小柱，得到结合物I； 2)将步骤1)所得结合物I依次进行淋洗和洗脱，收集洗脱液，浓缩，得到所述植物内源小肽。 2.一种筛选植物内源小肽的方法，包括： 3)向植物原料中加入提取溶剂，混匀后静置提取，去除残渣后，收集提取液进行如下处理b；所述处理b为依次上样于2种保留机制互补的装填有混合型离子交换与反相保留吸附剂的Oasis固相萃取小柱，得到结合物II和III； 4)将步骤3)所得结合物II和III分别进行淋洗和洗脱，收集洗脱液并合并于同一容器中，浓缩，得到所述植物内源小肽。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)和步骤3)中，所述提取溶剂为质量百分浓度为50％-100％的甲醇水溶液或质量百分浓度为0.1％-2％的三氟乙酸水溶液；所述植物原料的用量不超过1000mg或不超过200mg或不超过100mg；所述植物原料与提取溶剂的用量比为100mg：0.5-5mL；所述提取包括涡旋混匀，超声，4℃下过夜放置并离心；具体的，所述超声中，时间为1-60min；具体为2-10min；超声功率为200-300W；所述离心步骤中，离心转速为9000-20000rpm；离心力为10000-20000g；离心时间为10-20min；所述混合型离子交换与反相保留吸附剂的Oasis固相萃取小柱选自混合模式强阳离子交换柱(Mixed-Mode Strong Cation-Exchange，MCX)、混合模式若阳离子交换柱(Mixed-Mode Weak Cation-Exchange，WCX)、混合模式强阴离子交换柱(Mixed-Mode StrongAnion-Exchange，MAX)和混合模式弱阴离子交换柱(Mixed-Mode Weak Anion-Exchange，WAX)中至少一种。 4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)和步骤4)淋洗步骤中，淋洗溶剂为适用于反相与离子交换机理的洗脱溶剂。 5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述淋洗溶剂选自选自水、甲醇、乙腈、甲酸水溶液、三氟乙酸水溶液、甲酸的甲醇溶液和甲酸的乙腈溶液；所述甲酸水溶液、甲酸的甲醇溶液和甲酸的乙腈溶液中，甲酸的质量百分浓度均为0.1-10％；所述三氟乙酸水溶液中，三氟乙酸的质量百分浓度为0.1-5％；所述含甲酸的乙腈溶液中，甲酸的质量百分浓度具体为0.1-10％。 6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)和步骤4)洗脱步骤中，洗脱为一步完成或分步完成；所述一步完成中，所用洗脱试剂为含有三氟乙酸或氨水的甲醇溶液；其中，MCX小柱或WAX小柱使用含NH4OH的甲醇水溶液，NH4OH的质量百分浓度为1-5％；甲醇的质量百分浓度为60-80％，其余成分为水； WCX小柱或MAX小柱使用含三氟乙酸的甲醇水溶液，三氟乙酸的质量百分浓度为0.1-5％；甲醇的质量百分浓度为60-98％，其余成分为水；所述分步完成包括：第一步选用酸性水溶液或碱性水溶液破坏离子交换作用；第二步选用甲醇水溶液或乙腈水溶液作为洗脱试剂；所述第一步中，所述酸性水溶液为三氟乙酸水溶液或氨水溶液，其中MCX小柱或WAX小柱使用氨水溶液，NH4OH的质量百分浓度为1-5％；WCX小柱或MAX小柱使用三氟乙酸水溶液，三氟乙酸的质量百分浓度为0.1-5％；所述第二步中，所述甲醇水溶液中，甲醇的质量百分浓度为60-100％；所述乙腈水溶液中，乙腈的质量百分浓度为60-100％。 7.权利要求1-6任一所述方法在下述任意一种中的应用： a、植物小肽的定量分析； b、植物小肽的定性分析； c、植物内源活性小肽的筛选； d、植物内源活性小肽的鉴定。 8.一种分析植物内源小肽的方法，包括如下步骤：将权利要求1-6中任一方法所得纯化产物溶于溶剂中，进行LC-MS/MS检测。 9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述溶剂选自含有酸的乙腈水溶液、含有酸的甲醇水溶液和含有酸的水溶液中至少一种；具体的，所述酸为甲酸或三氟乙酸；所述酸在所述酸的乙腈水溶液、含有酸的甲醇水溶液和含有酸的水溶液中的质量百分浓度为0.05-2％；所述含有酸的乙腈水溶液中，乙腈的质量百分浓度为0-10％；所述含有酸的甲醇水溶液中，甲醇的质量百分浓度为0-10％。