详情

原文传递液相色谱串联质谱法检测多种氨基酸、激素和神经酰胺的方法

专利名称：	液相色谱串联质谱法检测多种氨基酸、激素和神经酰胺的方法
摘要：	本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种液相色谱串联质谱法联合检测血液及脑脊液中多种氨基酸、激素和神经酰胺的方法。具体包括：分别制备得到标准曲线方程I和标准曲线方程II，对待测样本进行前处理，分别获得用于检测氨基酸和激素的进样样本I和用于检测神经酰胺的进样样本II；使用高效液相色谱质谱联用仪分别进行检测，将进样样本I的检测结果代入标准曲线方程I，将进样样本II的检测结果代入标准曲线方程II，得到待测样本中多种氨基酸、激素和神经酰胺的含量。本发明可通过一次采集血液和脑脊液，实现7种氨基酸、11种激素和3种神经酰胺三大类物质的联合检测。本发明的检测方法大大节省了分析时间，降低了分析成本。
专利类型：	发明专利
申请人：	首都医科大学附属北京天坛医院;北京和合医学诊断技术股份有限公司
发明人：	王玉飞;贾永娟;张国军;倪君君;韩冰清;姜文灿;赵金宝;任晓航
专利状态：	有效
申请日期：	2023-08-24T00:00:00+0800
发布日期：	2023-11-10T00:00:00+0800
申请号：	CN202311078247.0
公开号：	CN117030898A
代理机构：	北京开阳星知识产权代理有限公司
代理人：	董亚男
分类号：	G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G;G01;G01N;G01N30;G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72
申请人地址：	100070 北京市丰台区南四环西路119号;
主权项：	1.一种液相色谱串联质谱法联合检测多种氨基酸、激素和神经酰胺的方法，其特征在于，所述氨基酸包括异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、犬尿氨酸；所述激素包括孕酮、孕烯醇酮、二氢孕酮、四氢孕酮、别孕烯醇酮、睾酮、脱氢表雄酮、雄烷二醇(3α,17β)、二氢睾酮、雌三醇和雌二醇；所述神经酰胺包括：神经酰胺C16(d18:1/16:0)、神经酰胺C18(d18:1/18:0)和神经酰胺C24(d18:1/24:0)；所述方法至少包括以下步骤： S1、分别制备得到标准曲线方程I和标准曲线方程II，配制标准溶液I，使用高效液相色谱质谱联用仪对所述标准溶液I进行检测，获得用于计算激素和氨基酸含量的标准曲线方程I；配制标准溶液II，使用高效液相色谱质谱联用仪分别对所述标准溶液II进行检测，获得用于计算神经酰胺含量的标准曲线方程II； S2、待测样本的前处理，包括：将所述待测样本分为3份：待测样本a、待测样本b和待测样本c；取混合氨基酸内标工作液和所述待测样本a，加入蛋白沉淀剂A混匀后离心，取上清液I，加入水稀释得到溶液I；取混合激素内标工作液和所述待测样本b混匀，进行固相萃取，收集含激素成分的洗脱液，干燥后与所述溶液I混合，离心后的上清作为进样样本I，用于进样分析；取混合神经酰胺内标工作液和所述待测样本c，加入蛋白沉淀剂B混匀后离心，取上清液为进样样本II；所述蛋白沉淀剂A选自甲醇；所述蛋白沉淀剂B选自甲醇和异丙醇体积比为1.5～2.5：1的混合溶剂； S3、分别检测所述进样样本I和所述进样样本II，包括：使用高效液相色谱质谱联用仪分别对所述进样样本I和所述进样样本II进行检测，将进样样本I的检测结果代入所述标准曲线方程I，将进样样本II的检测结果代入所述标准曲线方程II，得到所述待测样本中多种氨基酸、激素和神经酰胺的含量。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1包括：内标工作液的配制、标曲工作液的配制和标准溶液的配制，所述内标工作液的配制包括：分别配制所述混合激素内标工作液、所述混合氨基酸内标工作液、所述混合神经酰胺内标工作液；所述标曲工作液的配制包括：分别配制混合激素标曲工作液、混合氨基酸标曲工作液、混合神经酰胺标曲工作液。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述标准溶液I的配制包括：取所述混合氨基酸内标工作液和梯度浓度的所述混合氨基酸标曲工作液，加入所述蛋白沉淀剂A混匀得到混合液，所述混合液中加入水，混匀得到溶液I’；取混合激素内标工作液和梯度浓度的混合激素标曲工作液，干燥后用所述溶液I’溶解；制成梯度浓度的所述标准溶液I；所述标准溶液II的配制包括：取所述混合神经酰胺内标工作液、梯度浓度的所述混合神经酰胺标曲工作液和所述蛋白沉淀剂B，制成梯度浓度的所述标准溶液II；将所述标准溶液I采用高效液相色谱质谱联用仪进行检测，获得所述标准曲线方程I；将所述标准溶液II采用高效液相色谱质谱联用仪进行检测，获得所述标准曲线方程II。 4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述混匀的条件为1000～2500rpm下涡旋混匀30s～1min；和/或，所述混合氨基酸内标工作液与所述混合氨基酸标曲工作液的体积比为1：1；所述混合氨基酸内标工作液、所述蛋白沉淀剂A的体积比为1：15～20；所述混合液与水的体积比为1：8～10；和/或，所述混合激素内标工作液、所述混合激素标曲工作液的体积比为1：1；和/或，所述混合神经酰胺内标工作液、所述混合神经酰胺标曲工作液、所述蛋白沉淀剂B的体积比为1：1：25～35。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S2中，在所述进样样本I的制备过程中，所述混匀的条件为2000～2500rpm混匀3～5min，所述离心的条件为12000～14000rpm离心5～10min；和/或，所述固相萃取的洗脱液采用乙腈，并在收集洗脱液前依次用水、体积百分比为20％～40％的甲醇水溶液、体积百分比为5％～15％的乙腈水溶液进行淋洗；和/或，在所述进样样本II的制备过程中，所述混匀的条件为2000～2500rpm混匀3～5min，所述离心的条件为12000～14000rpm离心5～10min。 6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，在S2中，所述待测样本为血清样本时：所述待测样本a、所述待测样本b和所述待测样本c的体积比为1：20：1；和/或，取所述混合激素内标工作液和所述待测样本b混匀后、进行固相萃取前，还有加入所述蛋白沉淀剂A、混匀、离心、取上清液II加入水复溶的步骤；在进样样本I的制备过程中，所述待测样本a与混合氨基酸内标工作液的体积比为1：1，所述待测样本a与所述蛋白沉淀剂A的体积比为1：15～20；所述上清液I与水的体积比为1：8～10；所述待测样本b与混合激素内标工作液的体积比为20：1，所述待测样本b与蛋白沉淀剂A的体积比为1：2～2.5；所述上清液II与水的体积比为1：1～1.2；和/或，在进样样本II的制备过程中，所述待测样本c与所述混合神经酰胺内标工作液的体积比为1：1，所述待测样本c与蛋白沉淀剂B的体积比为1：25～35。 7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待测样本为血清样本时；所述待测样本a、所述待测样本b和所述待测样本c的体积分别为10～20μL、200～400μL、10～20μL。 8.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样本为脑脊液样本时：所述待测样本a、所述待测样本b和所述待测样本c的体积比为1：25：5；和/或，在所述进样样本I的制备过程中，待测样本a与混合氨基酸内标工作液的体积比为2：1，待测样本a与蛋白沉淀剂A的体积比为2：15～20，上清液I与水的体积比为1：8～10；和/或，所述待测样本b与混合激素内标工作液的体积比为50：1；和/或，在所述进样样本II的制备过程中，所述待测样本c与混合神经酰胺内标工作液的体积比为10：1，所述待测样本c与蛋白沉淀剂B的体积比为1：2.5～3.5。 9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，待测样本a、待测样本b和待测样本c的体积分别为20～30μL、500～750μL、100～150μL。 10.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，使用高效液相色谱质谱联用仪分析时色谱柱采用五氟苯基色谱柱，优选Kinetex F5色谱柱，填料粒径为2.6μm。 11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，使用高效液相色谱质谱联用仪对所述标准溶液I和所述进样样本I进行检测时：色谱分析条件为：流动相：A相：含0.4～0.5mmol/L氟化铵的水；B相：甲醇；流速为：0.4～0.5mL/min；梯度洗脱条件： 0.00～1.00min，A相采用浓度A1，B相采用浓度B1； 1.01～3.00min，A相采用浓度A2，B相采用浓度B2； 3.00～3.50min，A相由浓度A2匀速变化至浓度A3，B相：由浓度B2匀速变化至浓度B3； 3.50～12.00min，由浓度A3匀速变化至浓度A4，B相：由浓度B3匀速变化至浓度B4； 12.01～12.50min，由浓度A4匀速变化至浓度0，B相：由浓度B4匀速变化至100％； 12.50～13.00min，A相为0％；B相为100％； 13.01～15.00min，A相采用浓度A1，B相采用浓度B1；浓度A1选自95％～90％，浓度B1选自5％～10％，浓度A1+浓度B1＝100％；浓度A2选自85％～75％，浓度B2选自15％～25％，浓度A2+浓度B2＝100％；浓度A3选自60％～65％，浓度B3选自35％～40％，浓度A3+浓度B3＝100％；浓度A4选自10％～20％，浓度B4选自80％～90％，浓度A4+浓度B4＝100％；优选的，质谱分析条件为：采用电喷雾离子源，正负离子模式同时采集，多反应监测；雾化温度：500℃～600℃；电喷雾电压：5500/-4000V；气帘气：20～30L/min；碰撞气：6～10L/min；雾化气：55～65L/min；辅助气：55～65L/min。 12.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，使用高效液相色谱质谱联用仪对所述标准溶液II、所述进样样本II进行检测时的色谱分析条件为：流动相：A相：含有体积百分比为0.1％～0.2％甲酸和1～2mmol/L乙酸铵的水溶液；B相：体积比为1.5～2.5：1的甲醇和异丙醇混合溶剂；流速为：0.5～0.6mL/min；梯度洗脱条件： 0.00～1.50min，A相采用浓度A1，B相采用浓度B1； 1.50～2.00min，A相由浓度A1匀速变化至浓度A2，B相：由浓度B1匀速变化至浓度B2； 2.00～6.00min，A相采用浓度A2，B相采用浓度B2； 6.01～7.50min，A相采用浓度A1，B相采用浓度B1；浓度A1选自15％～20％，浓度B1选自80％～85％，浓度A1+浓度B1＝100％；浓度A2选自0～5％，浓度B2选自95％～100％，浓度A2+浓度B2＝100％；优选的，质谱分析条件为：采用电喷雾离子源，正离子模式采集，多反应监测；雾化温度：500℃～600℃；电喷雾电压：5500V；气帘气：20～30L/min；碰撞气：6～10L/min；雾化气：30～40L/min；辅助气：30～40L/min。