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原文传递一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒及其应用

专利名称：	一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒及其应用
摘要：	本发明涉及一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒及其应用。双抗体夹心ELISA试剂盒包括：包被有鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体5G4的酶标板、HRP标记的鼠抗EDSV Fiber蛋白另一单克隆抗体6G6，还包括封闭液、稀释液、洗涤液、显色液及终止液。该试剂盒最低病毒的检出量为102.9TCID50/mL，并且不与NDV、IBDV、IBV和FAdV‑4发生反应，批内和批间重复变异系数小于10％。与RT‑PCR方法比较，双抗体夹心ELISA试剂盒检测的符合率为93.33％。本发明的EDSV抗原双抗体夹心ELISA检测方法具有良好的敏感性、特异性和重复性，能用于EDSV的检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	河南;41
申请人：	河南省农业科学院
发明人：	魏蔷;张改平;刘运超;宋亚鹏;柴书军
专利状态：	有效
申请日期：	2023-08-12T00:00:00+0800
发布日期：	2023-11-10T00:00:00+0800
申请号：	CN202311012741.7
公开号：	CN117031019A
代理机构：	郑州市华翔专利代理事务所(普通合伙)
代理人：	张爱军
分类号：	G01N33/569;G01N21/78;G01N33/577;G01N33/58;C07K16/08;C12N15/70;G;C;G01;C07;C12;G01N;C07K;C12N;G01N33;G01N21;C07K16;C12N15;G01N33/569;G01N21/78;G01N33/577;G01N33/58;C07K16/08;C12N15/70
申请人地址：	450002 河南省郑州市金水区花园路116号
主权项：	1.一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，包括封闭液、稀释液、洗涤液、显色液及终止液，酶标板上包被有鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体5G4、HRP标记的鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体6G6，所述包被单克隆抗体5G4或抗体片段的重链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.1所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.2所示；所述单克隆抗体6G6或抗体片段的重链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.3所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.4所示。 2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体5G4由保藏编号为CCTCCNO:C2023213的杂交瘤细胞株5G4分泌。 3.根据权利要求1所述的一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体6G6由保藏编号为CCTCC NO:C2023214的杂交瘤细胞株6G6分泌。 4.根据权利要求1所述的一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，其中封闭液为5％脱脂乳，稀释液和洗涤液为PBST缓冲液；显色液为TMB，终止液为2M H2SO4。 5.根据权利要求1所述的一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体的制备方法为：通过PCR扩增获得EDSV Fiber基因，将其与原核表达载体pET28a连接，构建重组质粒pET28a-Fiber，转化大肠杆菌BL21，通过IPTG诱导表达获得Fiber蛋白，然后通过镍柱纯化获得纯化的Fiber蛋白，以此作为免疫原免疫小鼠，制备多株鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体。 6.根据权利要求5所述的一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，将纯化后的Fiber蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0细胞进行融合，制备杂交瘤细胞，将细胞上清进行间接ELISA和间接免疫荧光验证，筛选得到阳性克隆细胞株，经过三次亚克隆后，将杂交瘤细胞株注射小鼠进行腹水的制备，最后将得到的腹水进行纯化，得到鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体5G4、6G6。 7.一种权利要求1所述鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： (1)包被：纯化后的鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体5G4稀释后包被酶标板，4℃过夜，捕获抗体5G4的包被浓度为219ng/孔； (2)封闭：采用5％脱脂乳做封闭液，37℃封闭酶标板2h； (3)加样：加入待检样品，37℃孵育1h进行反应； (4)加酶标二抗：加入稀释后的HRP标记的鼠抗EDSV Fiber蛋白检测抗体即HRP-6G6，37℃作用1h；检测抗体HRP-6G6的稀释倍数为1:6400； (5)显色：加入TMB底物避光显色，显色时间为15min； (6)终止：加入2M H2SO4终止液，终止反应； (7)读值：酶标仪测定OD450。 8.单克隆抗体5G4、6G6在检测鸡减蛋综合征病毒试剂中的应用。 9.单克隆抗体5G4、6G6在检测鸡减蛋综合征病毒的试剂盒中的应用。
所属类别：	发明专利