详情

原文传递一种基于三嵌段探针单分子尺度邻近结合诱导杂交的电化学适配体传感器及其应用

专利名称：	一种基于三嵌段探针单分子尺度邻近结合诱导杂交的电化学适配体传感器及其应用
摘要：	本发明提供了一种基于三嵌段探针单分子尺度邻近结合诱导杂交的电化学适配体传感器及其应用，所述电化学适配体传感器包括自组装在金电极上的三嵌段多腺嘌呤DNA探针、目标蛋白临近探针和生物素标记的抗体；所述三嵌段多腺嘌呤DNA探针包括polyA序列和连接在polyA序列两侧的侧翼序列，包括第一侧翼序列和第二侧翼序列；所述目标蛋白临近探针包括目标蛋白临近探针A和目标蛋白临近探针B；所述生物素标记的抗体为识别目标蛋白的抗体。本发明所述传感器具有极高的灵敏度和特异性，通过检测催化氧化还原电流变化指示目标蛋白的浓度。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	上海市计量测试技术研究院(中国上海测试中心、华东国家计量测试中心、上海市计量器具强制检定中心)
发明人：	李兰英;刘刚;闻艳丽;陈玉茹;王乐乐;霍银波;陶晴;宋雅楠;许丽;郭瑞妍;杨雪;梁文
专利状态：	有效
申请日期：	2023-08-28T00:00:00+0800
发布日期：	2023-11-28T00:00:00+0800
申请号：	CN202311089864.0
公开号：	CN117129544A
代理机构：	北京品源专利代理有限公司
代理人：	刘锴
分类号：	G01N27/327;G01N33/68;G01N33/531;G01N27/48;G01N27/30;G;G01;G01N;G01N27;G01N33;G01N27/327;G01N33/68;G01N33/531;G01N27/48;G01N27/30
申请人地址：	201203 上海市浦东新区张衡路1500号
主权项：	1.一种基于三嵌段探针单分子尺度邻近结合诱导杂交的电化学适配体传感器，其特征在于，所述电化学适配体传感器包括自组装在金电极上的三嵌段多腺嘌呤DNA探针、目标蛋白临近探针和生物素标记的抗体；所述三嵌段多腺嘌呤DNA探针包括polyA序列和连接在polyA序列两侧的侧翼序列，包括第一侧翼序列和第二侧翼序列；所述目标蛋白临近探针包括目标蛋白临近探针A和目标蛋白临近探针B；所述生物素标记的抗体为识别目标蛋白的抗体。 2.根据权利要求1所述的电化学适配体传感器，其特征在于，所述侧翼序列由侧翼连接序列和侧翼互补序列组成；优选地，所述侧翼连接序列为(T)n，其中n为整数，n选自8-12；优选地，所述侧翼互补序列的碱基数为6-10个碱基；优选地，所述目标蛋白临近探针由延伸连接序列、蛋白识别序列、延伸互补序列组成；优选地，所述延伸连接序列为(T)n，其中n为整数，n选自35-45；优选地，所述延伸互补序列的碱基数为6-10个碱基。 3.根据权利要求1或2所述的电化学适配体传感器，其特征在于，所述第一侧翼序列由侧翼连接序列和侧翼互补序列1组成；所述目标蛋白临近探针A由延伸连接序列、蛋白识别序列A、延伸互补序列1组成；其中，侧翼互补序列1与目标蛋白临近探针A的延伸互补序列1互补配对；优选地，所述第二侧翼序列由侧翼连接序列和侧翼互补序列2组成；所述目标蛋白邻位探针B由延伸连接序列、蛋白识别序列B、延伸互补序列2组成；其中，侧翼互补序列2与目标蛋白临近探针B的延伸互补序列2互补配对。 4.根据权利要求1-3中任一项所述的电化学适配体传感器，其特征在于，所述polyA序列的碱基数为8-40，优选为10-20；优选地，所述电化学适配体传感器还包括链霉素修饰的辣根过氧化酶。 5.一种基于三嵌段探针单分子尺度邻近结合诱导杂交的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：构建权利要求1-4中任一项所述的基于三嵌段探针单分子尺度邻近结合诱导杂交的电化学适配体传感器；建立电化学电流信号与目标蛋白的浓度之间的线性回归方程；通过检测待测样品的电化学电流信号指示测待测样品中目标蛋白的浓度。 6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述传感器采用包括如下步骤的方法构建得到： (1)三嵌段polyA捕获探针在金电极表面组装：将经过物理打磨的金电极进行电化学清洗，将三嵌段polyA捕获探针溶液滴加到金电极表面进行恒温反应组装； (2)金电极表面封闭：采用封闭试剂封闭处理组装后的金电极； (3)将目标蛋白临近探针、待测溶液混合后加在封闭后的金电极上，恒温孵育；再依次加生物素标记的抗体和链霉素修饰的辣根过氧化酶。 7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述电化学清洗在硫酸溶液中进行，所述硫酸溶液的浓度为0.02-1μM；优选地，步骤(1)中，所述三嵌段polyA捕获探针溶液中三嵌段polyA捕获探针的浓度为0.01-3μM，溶剂为TE组装缓冲液，pH 6.8-7.2；优选地，步骤(1)中，所述反应组装的时间为8-12小时；所述反应组装的温度为20-25℃；优选地，步骤(2)中，所述封闭试剂为质量浓度为0.5-1.5％的酪蛋白溶液；所述酪蛋白溶液的溶剂为PBS缓冲液，pH 7.0-7.4；优选地，步骤(2)中，所述封闭处理的时间为25-35分钟；所述封闭处理的温度为20-25℃。 8.根据权利要求6或7所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，将所述目标蛋白临近探针置于PBS缓冲液中，在89-95℃变性4-5分钟再冷却至20-25℃；优选地，步骤(3)中，所述目标蛋白临近探针与待测溶液孵育时，所述目标蛋白临近探针的终浓度为20-80nM；优选地，步骤(3)中，所述恒温孵育的温度为35-39℃；所述恒温孵育的时间为1.5-2.5小时；优选地，步骤(3)中，所述生物素标记的抗体的浓度为0.5-2μg/mL；优选地，步骤(3)中，加生物素标记的抗体后在20-25℃反应0.5-1.5小时；加链霉素修饰的辣根过氧化酶后在20-25℃反应10-15分钟。 9.一种基于三嵌段探针单分子尺度邻近结合诱导杂交的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包括权利要求1-4中任一项所述的基于三嵌段探针单分子尺度邻近结合诱导杂交的电化学适配体传感器。 10.权利要求1-4中任一项所述的基于三嵌段探针单分子尺度邻近结合诱导杂交的电化学适配体传感器和/或权利要求9所述的基于三嵌段探针单分子尺度邻近结合诱导杂交的检测试剂盒在蛋白定量检测中的应用。
所属类别：	发明专利