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原文传递双重信号放大作用的牛奶中金黄色葡萄球菌的检测方法

专利名称：	双重信号放大作用的牛奶中金黄色葡萄球菌的检测方法
摘要：	本发明公开了双重信号放大作用的牛奶中金黄色葡萄球菌的检测方法，属于生物传感技术领域。该技术利用金‑铂纳米复合材料和DNA模拟酶合成了对H₂O₂具有良好的双重催化作用的纳米探针，并利用石墨烯/金纳米颗粒纳米复合材料修饰电极以提高修饰电极的电子传递能力，从而实现对金黄色葡萄球菌的快速、高灵敏检测。在优化的实验条件下，该电化学免疫传感器对金黄色葡萄球菌表现出较为宽广的线性检测范围。此外，该传感器已成功用于对纯牛奶以及酸奶样品中的金黄色葡萄球菌的定量检测。相比于传统的平板菌落计数法等方法，本发明方便快速、操作简单、灵敏度高，实现了对金黄色葡萄球菌的快速、高灵敏检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	江苏大学
发明人：	韩恩;程喜红;丁文龙;蔡健荣
专利状态：	有效
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201711232623.1
公开号：	CN108020587A
分类号：	G01N27/327(2006.01)I;G01N27/36(2006.01)I;G01N27/30(2006.01)I;G01N33/569(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N27;G01N33;G01N27/327;G01N27/36;G01N27/30;G01N33/569
申请人地址：	212013 江苏省镇江市京口区学府路301号
主权项：	双重信号放大作用的牛奶中金黄色葡萄球菌的检测方法，其特征在于按照下述步骤进行：(1)金纳米颗粒(AuNPs)的制备将一定量的HAuCl₄·6H₂O溶液加热煮沸并不断搅拌，然后加入柠檬酸钠溶液继续煮沸4min，直至颜色变成酒红色并保持不变，放置冷却到室温，并放于冰箱中保存；(2)石墨烯‑金纳米颗粒纳米复合材料(GO‑AuNPs)的制备将羧基化氧化石墨烯(GO)溶液和聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)溶液混合搅拌0.5h，使其混合均匀，然后离心并清洗，接着加入上述AuNPs溶液混合搅拌0.5h，使其混合均匀，然后离心并清洗并置于4℃的冰箱中保存；(3)金‑铂纳米复合材料(Au@Pt NPs)的制备将HAuCl₄·6H₂O溶液加热煮沸并不断搅拌，然后加入柠檬酸钠溶液，继续煮沸几分钟，直至颜色变成酒红色并保持不变；随后将抗坏血酸溶液(过量的)加入到煮沸的AuNPs溶液中，随后加入一定量的K₂PtCl₆溶液；继续加热，直至颜色变为黑色并保持不变；然后将Au@Pt NHs溶液离心并水洗三次，烘干成粉末备用；(4)纳米探针的制备将Au@Pt溶液与链酶亲和素(SA)溶液在室温下反应1h，并不断搅拌；然后将溶液于8000rpm下离心10min，并用PBS(pH 5.5)洗三次，除去未反应的SA；然后再将DNA‑Hemin复合物(将DNA溶液与Hemin溶液在37℃的摇床里反应1h；)加入到上述溶液中，于室温下反应1h，并不断搅拌，然后离心并清洗；最后用PBS(pH 7.4)溶液定容，保存在4℃冰箱中备用；(5)金黄色葡萄球菌‑生物素化抗体复合物的制备将一定浓度的金黄色葡萄球菌(S.aureus)溶液与生物素化的抗金葡抗体混匀置于37℃下反应40min并不断振动，然后离心，并用PBS清洗多余的抗体；(6)工作电极的修饰将裸玻碳电极(GCE)依次用粒径为0.3、0.05μm的氧化铝粉末反复打磨至镜面，再依次用体积比为1:1的HNO₃水溶液、质量浓度为95％的乙醇、二次蒸馏水分别超声清洗2min，最后用氮气吹干备用；将(2)中制备的GO‑AuNPs混合液滴涂于玻碳电极表面，置于红外灯下烘干，并用PBS清洗三次；然后将电极浸入到0.5mg/mL链酶亲和素(SA)溶液里并于4℃下反应1h，从而将SA固定在修饰电极表面，然后再用PBS清洗三次以除去未反应SA；为了防止非特异性吸附，将1％BSA溶液滴加在上述修饰电极表面反应1h，然后用PBS清洗三次并置于4℃冰箱中备用；(7)传感器的制备及金黄色葡萄球菌的检测取10μL(5)中复合溶液加入到(6)中已制备好的电极上反应0.5h并清洗，然后取10μL(4)中的纳米探针滴涂到上述电极表面，反应0.5h并清洗，然后进行电化学检测；将制得的免疫传感器作为工作电极，铂丝电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，组成三电极体系；将该三电极体系置于含20mM H₂O₂的PBS缓冲溶液里，利用时间‑电流(i‑t)曲线进行检测；以金黄色葡萄球菌浓度的对数为横坐标，对应的电流瞬间变化值为纵坐标，绘制标准曲线，进而获得相应的线性回归方程。
所属类别：	发明专利