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原文传递一种能够抑制弓形虫增殖的小分子抑制剂的筛选及应用方法

专利名称：	一种能够抑制弓形虫增殖的小分子抑制剂的筛选及应用方法
摘要：	本发明公开了一种能够抑制弓形虫增殖的小分子抑制剂的筛选方法，其利用Alphascreen实验初步选出11个小分子抑制剂和一个小分子促进剂，这12种药物都是临床用药。在细胞水平上对这12种药物进一步筛选，空斑实验证实GSK J4HCL明显抑制了弓形虫的增殖并通过胞内增殖实验确定了它对弓形虫的EC50值在4.5μM左右。AlphaScreen竞争性抑制实验评估GSK J4HCL抑制TgAtg8‑TgAtg3相互作用的IC50值为11.01μM。利用CCK8实验证明了该药抑制宿主细胞生长的IC50值为34.359μM，远大于该药对虫体的EC50值，说明GSK J4HCL是一个低毒且高效的抗弓形虫药物。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	温州医科大学
发明人：	刘淑贤;谭峰;张芳菲;华倩倩;曹佳欣;王炎;胡昕
专利状态：	有效
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201711364518.3
公开号：	CN107884587A
代理机构：	温州名创知识产权代理有限公司 33258
代理人：	曾建芳
分类号：	G01N33/68(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/68
申请人地址：	325000 浙江省温州市瓯海区东方南路38号温州市国家大学科技园孵化器
主权项：	一种能够抑制弓形虫增殖的小分子抑制剂的筛选方法，步骤如下：(1)纯化HIS‑TgAtg3蛋白选取正确的菌株大量诱导表达，收集菌体，100mL菌液沉淀重悬于10mL PBS缓冲液中，冰浴超声裂解，8000rpm，4℃离心10min收集上清液；1)取上清液10mL样品用0.45μM滤菌器过滤备用；2)混匀质量浓度为50％的NI‑NTA，吸取4mL的质量浓度为50％的NI‑NTA，置于底部有盖子的专用蛋白纯化管中，移去盖子，待完全沉淀，先用10mL灭菌水洗，流速靠重力作用；3)柱子预平衡:用2mL的pH＝7.4的磷酸缓冲液缓冲液(PBS)进行平衡30min，流速靠重力作用；4)将准备好的10mL样品上样，靠重力作用使重组蛋白His‑TgAtg3与镍柱结合；5)用8mL洗脱缓冲液洗柱子，洗脱缓冲液包括pH＝7.4的磷酸缓冲液和500mM的咪唑，并将洗脱缓冲液设置不同梯度备用；6)最后用最高浓度洗脱缓冲液将全部蛋白洗脱，取少量洗脱缓冲液做SDS‑PAGE蛋白电泳检测；7)纯化完毕后用平衡缓冲液平衡柱子，灌满20％量的乙醇，封好加样口，柱子存放4℃备用；8)用透析法将无机盐离子与目的蛋白分离，①透析袋的处理选取截留分子量大小合适的透析袋，并剪成合适的长度，用含0.372g/L EDTA、20g/L NaHCO₃的处理液煮沸15min，缓慢冷却后无菌水洗3次，降温备用；②透析将蛋白装入透析袋内，用无菌水作为交换液，将容器置于磁力搅拌器上，4℃搅拌透析过夜；9)BCA法测定蛋白浓度根据待测样品数量，配制适量的BCA工作液，BCA工作液包括BCA试剂A和BCA试剂B，两者的体积比为50：1，充分混匀，将标准蛋白稀释为0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL的浓度梯度，将稀释的标准蛋白加至96孔板中，每孔20μL；待测样品用PBS缓冲液稀释后加至96孔板中，每孔20μL；每孔加入200μLBCA工作液，37℃孵育30min；用酶标仪检测562nm吸光度值，根据标准曲线计算待测样品的蛋白质浓度。(2)纯化GST‑TgAtg8蛋白37℃过夜培养GST‑TgAtg8蛋白后，按照1:100重新接种于新的LB液体培养液中扩大培养，加IPTG诱导剂诱导4小时，收集诱导的菌液沉淀，加入PMSF超声离心后，留取蛋白上清液，0.45μM过滤器过滤后，冰上备用；1)将Glutathione‑Sepharose TM4B介质充分混匀后，取适量加入到放了一片筛板的层析柱中，介质用量根据蛋白产量决定，其最大载量为8mg/mL His标记蛋白介质；2)用5倍柱体积自备去离子水洗柱，共三次；3)用5倍柱体积的新配PBS洗柱，共三次；4)将上述步骤(2)纯化GST‑TgAtg8蛋白中的备用蛋白上清液加入纯化介质，4℃结合1小时；5)用10倍柱体积的新配PBS洗柱，将未结合的杂蛋白洗去，收集并保存穿透液；6)用已配置的洗脱缓进一步冲液洗柱，收集并保存穿透液；7)洗脱后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20％乙醇平衡，最后堵住层析柱下端的漏口，4℃保存下次使用；(3)Alphascreen小分子抑制剂筛选实验，生物素标记GST‑TgATG8蛋白后，与HIS‑TgAtg3蛋白及筛选的临床治疗的共1751个小分子药物按照预设的比例共同室温孵育1小时；再将Alphascreen受体磁珠和供体磁珠依次加入蛋白混合物中，在室温中孵育1小时；读板后分析数据；利用Alphascreen筛选出18个小分子抑制剂和一个小分子促进剂；(4)SPR竞争性抑制实验同Alphascreen竞争性抑制实验，纯化GST‑TgAtg8及HIS‑TgAtg3蛋白后，将DMSO溶液以及筛选出的18个小分子抑制剂和1个小分子促进剂分别加入原核表达的TgAtg8‑TgAtg3反应体系中，实时动态监测各小分子药物对TgAtg8‑TgAtg3的阻断作用，利用SPR实验进行反筛查，最终筛选出12个小分子抑制剂和一个小分子促进剂。
所属类别：	发明专利