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原文传递一种分析柞蚕茧中蛋白质组的方法

专利名称：	一种分析柞蚕茧中蛋白质组的方法
摘要：	本发明公开的是一种分析柞蚕茧中蛋白质组的方法，属于蛋白质组学领域，取样、分层、溶解、胶内酶解等步骤后，分析不同蚕茧层中的蛋白质分布情况，有助于分析柞蚕茧结构与性能的关系；本发明的有益效果是：本发明从蚕茧出发，蚕茧中保留有最完整的蛋白质成分，可实现对蛋白质组的全面综合分析；对柞蚕茧进行分层研究；本发明采用低钠盐体系溶解茧层，对比传统的高浓度中性盐溶液，可降低化学药品的用量，减少杂质离子的引入，缩短纯化处理时间，降低成本，无毒无害；本发明基于蛋白质组学技术，能够快速、高效、准确的对蛋白质进行检测和定量分析。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江理工大学
发明人：	胡智文;陈茹茹;李津;梁军龙;朱诚
专利状态：	有效
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201810236930.5
公开号：	CN108918637A
代理机构：	浙江纳祺律师事务所 33257
代理人：	郑满玉
分类号：	G01N27/447(2006.01)I;G01N30/02(2006.01)I;G01N30/06(2006.01)I;G01N1/28(2006.01)I;G01N1/30(2006.01)I;G01N1/34(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N27;G01N30;G01N1;G01N27/447;G01N30/02;G01N30/06;G01N1/28;G01N1/30;G01N1/34
申请人地址：	310018 浙江省杭州市下沙高教园区2号大街928号
主权项：	1.一种分析柞蚕茧中蛋白质组的方法，其特征在于：采取如下步骤：1)取样：取3个质量相同的同批柞蚕茧，剥去茧衣，分别编号为a、b、c；2)分层：将a、b、c置于去离子水中加热，将茧壳分为外层、中层、内层和蛹衬，分别记为a1、a2、a3、a4，b1、b2、b3、b4，c1、c2、c3、c4；将分层的茧层放入60℃烘箱干燥；3)溶解：称取同一质量的不同茧层，剪碎，置于0.5wt％Na2CO3溶液中，调节pH11～12，130℃下水热反应4～6h，冷却后，离心除去未完全溶解部分，得到蚕丝蛋白溶液的粗产物；4)纯化：将蚕丝蛋白溶液在4℃条件下蚕丝蛋白溶液的粗产物经过截留分子量为1000的膜透析24h，得到蚕丝蛋白溶液；5)冷冻干燥：将蚕丝蛋白溶液在‑30～‑10℃的低温中冷冻，经真空冷冻干燥后得到蚕丝蛋白粉末；6)SDS‑PAGE凝胶电泳：蚕丝蛋白粉末溶于CB 9.6缓冲液中，得到20μg/μL的溶解液；取5～10μL溶解液，加入等体积的上样缓冲液，在100℃条件下加热10min。冷却至室温后，将各样品和蛋白Marker加入10％～15％聚丙烯酰胺凝胶中，进行电泳实验。所述聚丙烯酰胺凝胶包括分离胶和浓缩胶；7)染色：电泳结束后，剥离浓缩胶，用去离子水将分离胶冲洗干净，置于固定液中固定25～35min；除去固定液，用去离子水清洗3～5次，每次10～20min；之后将分离胶浸入考马斯亮蓝G‑250染色液中，摇床染色3～5h；8)脱色：用去离子水清洗分离胶至条带清晰，背景透明；9)切胶脱色：将蛋白条带从分离胶上切下，置于干净的离心管中，用去离子水清洗2～3次后，进行还原和烷基化；再加入由25mM碳酸氢铵和50％乙腈配置的脱色液，超声处理，吸去脱色液后，重复一次，最后加入50～100μL乙腈，振荡脱水，待胶条变白后，吸去全部液体，冷冻干燥；10)胶内酶解：以1:50的浴比将胶条浸没于25mM碳酸氢铵中，加入2～10μg测序级且经过修饰的胰蛋白酶，在37℃下孵育12～16h。收集提取液后，再加入20～50μL萃取液(5％甲酸溶液和乙腈按体积比1:1混合)，重复提取胶条中的多肽片段；将提取液冷冻干燥后，重新溶于0.1％甲酸溶液中；11)质谱分析：进行LC‑MS/MS测试，采用蛋白质定量技术测定相对定量，将不同层的蛋白质种类和含量的数据进行综合分析，比较每层中各组分的相对含量。
所属类别：	发明专利