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原文传递一种海参蛋白质组的分析方法

专利名称：	一种海参蛋白质组的分析方法
摘要：	本发明涉及食品中蛋白质组的分析方法研究领域，具体地说是一种海参蛋白质组的分析方法。本发明所公开的海参蛋白质组的分析方法，通过研究高效的组织裂解液作为蛋白质提取和溶解体系，发展提取能力强、样品损失低的全蛋白质样品预处理新技术对海参样品中蛋白质进行提取，并进一步酶解；进而，通过液相色谱分级和高分辨质谱鉴定技术相结合，对海参样品中蛋白质进行定量；提高低丰度蛋白质定量分析的灵敏度，从而提高蛋白质组定量的覆盖度。本发明方法为高效且针对海参样品的蛋白质组提取、酶解、分级、鉴定分析方法，提高低丰度蛋白质定量分析的灵敏度及覆盖度，从蛋白质组学方面对海参样品中蛋白质进行差异分析。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	辽宁;21
申请人：	陈溪
发明人：	陈溪;林天野;吴慈;褚莹倩;贺舒文;黄大亮
专利状态：	有效
申请日期：	2019-08-09T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-08T00:00:00+0800
申请号：	CN201910731910.X
公开号：	CN110308228A
代理机构：	大连博晟专利代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	杨迪
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	116000 辽宁省大连市甘井子区促进西街67#16号楼3单元
主权项：	1.一种海参蛋白质组的分析方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行： S1、取海参组织，去肠，经过清洗过后，进行粉碎，放入研钵中，一边研磨一边快速向研钵中添加液氮，直至海参组织碎块呈固态的粉末状； S2、将海参粉末放置到微量离心管中，加入400 μL的6~10 mol/L脲素或十二烷基苯磺酸钠或 Triton X-100反相微乳液体系，并加入4~6 μL 蛋白酶抑制剂Cocktail，将超声管置于冰面上，在4℃的条件下进行超声处理，超声处理过程中工作时间为10s，间歇时间10s，运行3~6 min，然后在2000g、4℃下离心处理20~30min，取上清液，其中上清液即为海参组织可溶性全蛋白溶液； S3、用BCA定量试剂盒测定海参总蛋白的浓度，根据测定得出的蛋白浓度，折算膜上需上样的体积，为后续离心配平，加入一定体积的50 mM NH4HCO3溶液，使总体上样量为150 μL，并加入15 μL的100mM DTT，95℃孵育5min后离心，向离心超滤装置的超滤膜上加入100~200μL 50mM 的NH4HCO3溶液后在14000g、20℃下离心10~30min，1~2次；弃去收集管中废液，向超滤膜上加入用50mM NH4HCO3溶液配置的20mM碘乙酰胺溶液100 μL，振荡1min充分混合后，避光孵育20min，在14000g，20℃条件下离心10~30min，向超滤膜上加入10 mM NH4HCO3溶液在14000g，20℃下离心15min，重复两次，更换离心超滤装置收集管； S4、向第S3步骤中的超滤膜上加入5~8 μL胰蛋白酶溶液，用10mM NH4HCO3补充至50μL，充分振荡1min，使用Parafilm膜缠紧超滤膜，置于37℃下孵育4~18h；向超滤膜上加入50~150 μL超纯水，在14000g，20℃下离心10min，重复一次，得到含有海参组织可溶性全蛋白； S5、采用TMT10重标，标记10个样品，并记录每个标记物标记的10个样品，在室温下孵育1h，加入15 μL HCl-羟胺反应15min，终止反应，以此标记定量差异蛋白，冻干； S6、针对第S5步骤的样品用液相色谱分级，采用C18 高PH分级，5~55min，每2~3min收集流出液，冻干；用乙腈:水体积比为1:1~6:4的混合液200μL 溶解，分4~8组，合并其分级液，冻干后用流动相复溶； S7、采用液相色谱-高分辨质谱联用仪LC-MS/MS分析。 2.根据权利要求1所述的一种海参蛋白质组的分析方法，其特征在于：所述步骤S1中海参粉末0.08~0.12g，放置到 2mL微量离心管中。 3.根据权利要求1所述的一种海参蛋白质组的分析方法，其特征在于：所述步骤S3中测定蛋白浓度操作为：将步骤S2获得的上清液于离心管中，加超纯水稀释待测样品40倍，采用BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度。
所属类别：	发明专利