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原文传递一种分析桑蚕丝形成过程及蛋白质组变化的方法

专利名称：	一种分析桑蚕丝形成过程及蛋白质组变化的方法
摘要：	本发明公开的是一种分析桑蚕丝形成过程及蛋白质组变化的方法，本发明涉及蛋白质组学领域，标记相同蚕在相同饲养条件下所产的不同蚕丝长度段的蛋白质的表达情况，分析蚕丝形成过程的变化；本发明的有益效果是：本发明13C标记甘氨酸进行示踪分析，可得出不同摄取桑叶时间与茧丝形成的关系，且13C是无放射性稳定同位素，对桑蚕生长发育无影响；本发明采用平板吐丝技术，改变桑蚕结茧的生理习性，保证蚕丝分段收集的准确性；本发明对蚕丝采取分段收集，可实现对桑蚕吐丝过程中蛋白质不同表达的研究；本发明采用低钠盐体系溶解茧层，对比传统的高浓度中性盐溶液，可降低化学药品的用量，减少杂质离子的引入，缩短纯化处理时间，降低成本，无毒无害。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江理工大学
发明人：	王秉;梁军龙;陈茹茹;李津;周莲
专利状态：	有效
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201810236939.6
公开号：	CN108489785A
代理机构：	浙江纳祺律师事务所 33257
代理人：	郑满玉
分类号：	G01N1/28(2006.01)I;G01N27/447(2006.01)I;G01N27/62(2006.01)I;G01N30/02(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N1;G01N27;G01N30;G01N1/28;G01N27/447;G01N27/62;G01N30/02
申请人地址：	310018 浙江省杭州市下沙高教园区2号大街928号
主权项：	1.一种分析桑蚕丝形成过程及蛋白质组变化的方法，其特征在于采用步骤如下：1)取A、B、C、D、E同批蚕卵，在相同外界条件下喂养至5龄第3天；2)将步骤1)中A、B、C、D、E组分别在5龄第4、5、6、7、8天喂养喷洒13C标记甘氨酸的同种桑叶；3)待步骤2)5组桑蚕的蚕熟率在90％～95％时，将熟蚕布放到平板吐丝床上，布放密度在0.5～1kg/m2；4)分别收集步骤3)5组桑蚕0～100m、200～400m、400～700m、700～1200m的蚕丝，编号为甲、乙、丙、丁；5)将步骤4)得到的不同组、不同长度的蚕丝用去离子水清洗3～5次，60℃干燥后，于Na2CO3溶液中水热溶解；溶液冷却后，除去未完全溶解部分，得到蚕丝蛋白溶液的粗产物；6)将步骤5)中蚕丝蛋白溶液的粗产物经过截留分子量为1000的膜透析24h，真空冷冻干燥后得到蚕丝蛋白粉末；7)将步骤6)得到的蚕丝蛋白粉末电泳分析：将蚕丝蛋白粉末溶于CB9.6缓冲溶液中，得到20μg/μL的溶解液；取5～10μL溶解液，经高温变性、离心制得蛋白样品，将样品的上层清液和蛋白Marker加入10～15％聚丙烯酰胺凝胶中，进行电泳实验；经考马斯亮蓝G‑250染色液后，分析其分子量分布；8)切胶脱色：将蛋白条带从分离胶上切下，置于干净的离心管中，用去离子水清洗2～3次，经还原烷基化和进一步脱色处理后，冷冻干燥；9)胶内酶解：将胶条浸没于25mM NaHCO3中，加入2～10μg测序级且经过修饰的胰蛋白酶，在37℃下孵育12～16h；收集提取液后，再加入30～50μL由5％甲酸溶液和乙腈按体积比1:1混合的萃取液，重复提取胶条中的多肽片段；将提取液冷冻干燥后，重新溶于0.1％甲酸溶液中；10)对步骤9)得到的溶液进行质谱分析：进行LC‑MS测试，可得到不同组桑蚕丝的不同长度内13C同位素分布及蛋白质的表达情况。
所属类别：	发明专利