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原文传递 PQQ对AGEs的抑制作用的研究方法

专利名称：	PQQ对AGEs的抑制作用的研究方法
摘要：	PQQ对AGEs的抑制作用的研究方法，是继PQQ（吡咯并喹呤醌）与Lys及Arg反应行为研究的方法之后，是PQQ与晚期糖基化终产物AGEs抑制作用的研究成果，属于生物分析技术领域。Nε‑（羧甲基）赖氨酸（CML），Nε‑（羧乙基）赖氨酸（CEL）是AGEs最主要的单体之一，本发明在测定CML、CEL的方法上进行了优化和改进，采用正‑丁醇/HCl衍生反应、固相萃取、UPLC‑MS/MS检测血浆中CML和CEL的含量，具有高效、准确、灵敏的特点。用所建立的方法分析D‑gal（D‑半乳糖）诱导衰老型大鼠和给予一定剂量的多奈哌齐（Don）和PQQ干预后，CML、CEL、蛋白结合CML和蛋白结合CEL的变化，为退行性疾病的发病机制和药物作用靶点提供新的依据。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	江苏省原子医学研究所
发明人：	顾晓波;周杏琴;蔡刚明;张荣军;俞惠新;包建东
专利状态：	有效
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201810927948.X
公开号：	CN108982700A
代理机构：	无锡市大为专利商标事务所(普通合伙) 32104
代理人：	时旭丹;张仕婷
分类号：	G01N30/02(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N30;G01N30/02
申请人地址：	214063 江苏省无锡市钱荣路20号
主权项：	1.PQQ对AGEs的抑制作用的研究方法，其特征在于步骤为：（1）标准溶液和内标溶液配制：分别准确称取适量CML和CEL标准品，用70%甲醇溶解配成浓度都为200μg /mL的CML和CEL标准溶液；分别称取适量的[2H2] ‑CML和[2H4] –CEL标准品，用70% 甲醇溶液溶解配制成均为50μg /mL的内标溶液，置于4℃冰箱中保存；移取适量CML和CEL标准溶液，准确加入内标溶液，用水稀释定容，混匀；系列标准溶液浓度为1～800 ng /mL，内标溶液浓度均为100 ng /mL；（2）血浆样品前处理：取50µL血浆样品，加pH 9.2、0.2M的 400 µL硼砂缓冲溶液，加100µL 100mM硼氢化钠溶液，涡旋混合，室温孵育3h，加 1000 µL、4℃的三氟乙酸，充分混匀，10000r/min 4℃离心10min，除去上清液；沉淀物加500µL 6 N HCl溶液，混合均匀，110℃孵育18h，进行蛋白水解；（3）加CML、CEL内标物取40μL步骤（2）所得蛋白水解溶液和含5µg/mL[2H2] ‑CML和 [2H4] –CEL的20μL内标物混合溶液进行充分混合；然后在70℃的氮气流下蒸发干燥；加V/V＝3/1的100µL正‑丁醇/HCl，70℃下衍生反应90min；然后在氮气下蒸发干燥，再溶解于200µL水中成溶液；取20µL上述溶液加20µL、5μg/mL的内标[13C6] ‑L‑赖氨酸溶解于500 µL 10 mmol/L 氨水中，为衍生后溶液；（4）将步骤（3）所得衍生后溶液以1mL/min的速度过CUALD11R3固相萃取小柱，完全富集后用2 mL、V/V＝60/40的乙腈‑0.1%三氟乙酸水溶液淋洗，真空抽干，再用5 mL 5% 氨水甲醇溶液洗脱，真空抽干并收集流出液，于40℃氮气吹干，浓缩干燥后，用50%乙腈溶液溶解残留物定容至1mL，涡旋混匀，过0. 22μm 滤膜后UPLC‑MS/MS分析；（5）CML、CEL和Lys在下列色谱条件下同时达到分离：反相C18色谱柱BEH C18 column (2.1×100mm,1.7μm)，20 mmol/L 95/5甲酸铵/乙腈5 min，25 min线性梯度至25/75甲酸铵/乙腈，柱温30℃，流速800 µL/min，进样体积2 µL；优化后的质谱条件：脱溶剂气温度400℃, 脱溶剂气流量600 L/h, 源温度110℃, 锥孔气流速50 L/h, 毛细管电压3000 V, 锥体电压30V；未标记的峰面积与对应的内标峰面积的比值计算出CML、CEL和Lys的浓度；计算蛋白结合CML和蛋白结合CEL浓度，以μmol/mol Lys表示；（6）线性范围与检出限在1～800 ng /mL 浓度范围内，分别以CML和CEL标准工作溶液浓度为横坐标X，ng/mL；以CML和CEL离子峰面积除以内标峰面积的值再与内标浓度（ng/mL）的乘积为纵坐标Y，绘制标准工作曲线，线性方程CML为：Y = 0. 6278X‑2.1037，R2=0.9999；CEL为：Y = 1. 6063X‑0.5004，R2=0.9998；将CML和CEL标准溶液稀释，按峰高与噪音的3倍信噪比计算得到CML和CEL最低检出限均为0. 05ng /mL；（7）精密度试验在确定的色谱条件下分别于1d内和连续3d内进样测定，CML日内和日间的RSD分别为0.79%和1.13% (n=6)；CEL日内和日间的RSD分别为0.88%和0.97% (n=6)；（8）色谱条件优化考察了不同流动相组成：纯水‑乙腈体系、甲酸‑乙腈体系、三氟乙酸‑乙腈体系、甲酸铵‑乙腈体系作为流动相的分离效果，发现甲酸铵‑乙腈体系时，待测物CML与CEL具有最佳的峰形，调整洗脱梯度为上述条件时，分离度和灵敏度较佳；（9）硼氢化钠浓度和孵育时间的选择由于在蛋白水解过程中赖氨酸与糖类反应可能转化为CML，导致测定值高于真实值，因此我们通过添加硼氢化钠抑制CML的形成，精密配置CML和CEL浓度为100ng/mL的标准溶液，按上述方法处理，添加不同浓度的硼氢化钠，实际测定值CML和CEL浓度对硼氢化钠浓度作图，当硼氢化钠浓度达到100mM，孵育时间3h时CML和CEL浓度不再下降；（10）不同固相萃取小柱对CML、CEL回收率的影响在空白血浆中分别加入含CML、CEL高、中、低浓度的血浆样品，分别采用ODS‑C18固相萃取小柱、Styre Screen® H2P固相萃取小柱、Sepax CUALD11R3固相萃取小柱处理，测定回收率，结果显示采用CUALD11R3固相萃取小柱处理，CML和CEL回收率最高，由于选择CUALD11R3固相萃取小柱能够与蛋白活性分子形成共价结合，还能同时测定蛋白结合CML 和蛋白结合CEL；（11）PQQ对血浆CML 、CEL、蛋白结合 CML 和蛋白结合CEL的影响D‑gal诱导造模6周后血浆游离CML、CEL、蛋白结合CML和蛋白结合CEL较对照组不同程度的升高，经多奈哌齐及PQQ给药后血浆CML含量均有显著下降；同时PQQ还能降低血浆CEL和蛋白结合CML；而多奈哌齐对二者无影响；然而无论PQQ还是多奈哌齐对血浆蛋白结合CEL均无影响。
所属类别：	发明专利