详情

原文传递 PQQ 与Lys及Arg反应行为研究的方法

专利名称：	PQQ 与Lys及Arg反应行为研究的方法
摘要：	PQQ与Lys及Arg反应行为研究的方法，是PQQ与晚期糖基化终产物AGEs抑制作用研究的第一部分，属于生物分析技术领域。Lys和Arg是参与葡萄糖反应的DNA主要游离氨基酸。为弄清其作用机制，本发明研究了PQQ与Lys及Arg反应行为，优化了UPLC色谱分离条件，避免使用高浓度的盐溶液对色谱柱的损伤，对映体也得到了分离。确定了PQQ浓度的标准曲线、精确度和检测限，PQQ与Arg、Lys反应游离PQQ浓度的测定，UPLC‑MS鉴别PQQ与Lys或Arg反应产物的结构，测定质谱结果发现了新的化合物PQQ‑Lys，PQQ‑Arg，而且还发现一分子PQQ同时能与一分子Lys和一分子Arg反应，得新化合物PQQ‑Lys‑Arg，PQQ通过与Lys和Arg反应抑制AGEs的形成，为探讨PQQ抑制AGEs形成的可能机制提供实验依据。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	江苏省原子医学研究所
发明人：	蔡刚明;周杏琴;钦晓峰;徐希杰;顾晓波;张荣军;俞惠新;包建东
专利状态：	有效
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201810928299.5
公开号：	CN109085269A
代理机构：	无锡市大为专利商标事务所(普通合伙) 32104
代理人：	时旭丹;张仕婷
分类号：	G01N30/02(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N30;G01N30/02
申请人地址：	214063 江苏省无锡市钱荣路20号
主权项：	1.PQQ 与Lys及Arg反应行为研究的方法，其特征在于步骤为：（1）UPLC色谱分离条件UPLC分析条件，色谱柱：ACQUiTY UPLC@ BEH C18 column (2.1×100mm,1.7μm)，流动相A：H2O+0.1%甲酸，B：甲醇；2/98 B/A洗脱5min，20min梯度洗脱至60/40 B/A； PDA检测；流动相中加入0.1%甲酸和梯度洗脱后，能将PQQ 与反应产物较好的分离；（2）标准曲线、精确度和检测限测定准确称取一定量的PQQ，配制成浓度为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mM的标准溶液，分别进样，所得积分面积对样品浓度作图，进行线性回归，得回归方程为y =6E+06x‑7834.9，R2 = 0.9998；线性范围0.2~1.0mM；在上述色谱条件下于同一天内连续进样6次，根据峰面积计算所得日内相对标准偏差为2.2%，n=6；隔天连续三天进样，日间标准偏差为4.3%，n=3；最小检出量为2.0ng，S/N≥3；（3）PQQ与Arg、Lys反应后游离PQQ浓度的测定将PQQ分别与Arg、Lys按v/v为1/1混合反应，另将PQQ与Arg和Lys按v/v/v为1/1/1混合反应，避光，置于37℃水浴孵育，于0、0.5、1、2、4、6、8、24h各时间点抽取反应液10μL，UPLC分析，所得峰面积代入线性方程，计算出游离PQQ的浓度；所得PQQ浓度对时间作图，得到PQQ‑反应时间曲线图，由PQQ‑反应时间曲线图可见PQQ与Lys反应速度快于PQQ与Arg，24h后PQQ与Lys反应完全；PQQ与Arg反应速度低于PQQ与Lys,8h后反应基本趋于稳定，PQQ未能完全反应；当Arg与Lys同时存在的情况下，PQQ迅速完全反应；（4）UPLC‑MS 鉴别PQQ与Lys或Arg反应产物的结构UPLC色谱条件同上，质谱检测器SQ Detector 2及PDA检测器，优化质谱参数：脱溶剂气温度：400℃；脱溶剂气流量：600 L/h；离子源温度：110℃；锥孔气流量：50L/h；毛细管电压：3000 V；锥孔电压：30V；质谱采用电喷雾正离子模式ESI+；PQQ与Arg反应液的ESI‑MS谱图中，得到的离子为m/z 441.32，是分子量为440的PQQ‑Arg的M+1分子离子峰；同时存在331，PQQ M+1峰；色谱图中有分子量440的PQQ‑Arg产物峰，保留时间1.55min，2.23min，还有对映体分子量330的PQQ色谱峰，保留时间3.29min；PQQ与Lys反应液的ESI‑MS谱图中，得到的离子为m/z 413.27(M+1)，414.20(M+2)，是分子量为412的PQQ‑Lys的分子离子峰；色谱图显示产物存在对映体：保留时间为1.75min和2.72min；当PQQ与Arg和Lys同时存在时，一分子的PQQ分别与一分子的Arg和一分子的Lys结合, 反应液的ESI‑MS谱图中，得到的离子为m/z 525.32(M+1)，526.69(M+2), 是分子量为524的PQQ‑Arg‑Lys的分子离子峰，色谱图显示存在对映体，保留时间为2.22min和2.76min。
所属类别：	发明专利