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原文传递 cTnI、NT-proBNP和D-dimer胸痛三联胶体金免疫试纸条的制备方法

专利名称：	cTnI、NT-proBNP和D-dimer胸痛三联胶体金免疫试纸条的制备方法
摘要：	本发明涉及cTnI、NT‑proBNP和D‑dimer胸痛三联胶体金免疫试纸条的制备方法，可有效解决cTnI、NT‑proBNP和D‑dimer的检测问题，分别制备胶体金标记用的、包被检测线用的抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体、抗NT‑proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体、抗D‑dimer蛋白质偶联物单克隆抗体；分别制备抗cTnI、NT‑proBNP、D‑dimer蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物，将胶体金标记物干燥、固化，将包被检测线用的抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体、抗NT‑proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体、抗D‑dimer蛋白质偶联物单克隆抗体至左向右依次分别包被于硝酸纤维膜上，成检测线，将抗鼠免疫球蛋白抗体包被于硝酸纤维膜上，成包被膜的质控线，即成。本发明工艺简单，新颖独特，能够快速简便、早期、有效诊断和鉴别各种急性胸痛。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	河南;41
申请人：	河南省科学院生物研究所有限责任公司
发明人：	刘丽;王玉金;杨书豪;杜迅;何蔚荭;安明理;李珊珊;周伏忠;胡宜亮;陈国参;孙晨阳
专利状态：	有效
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201811131136.0
公开号：	CN109061197A
代理机构：	郑州天阳专利事务所(普通合伙) 41113
代理人：	聂孟民
分类号：	G01N33/68(2006.01)I;G01N33/558(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/68;G01N33/558
申请人地址：	450003 河南省郑州市花园路28号
主权项：	1.一种cTnI、NT‑proBNP和D‑dimer胸痛三联胶体金免疫试纸条的制备，其特征在于，包括以下步骤：（1）、制备试纸条体：取基材PVC板（1），将引水玻璃纤维（3）、载体玻璃纤维（4）、硝酸纤维膜（2）、吸水棉浆板（5）自前向后依次粘贴于基材PVC板（1）上，在引水玻璃纤维（3）和载体玻璃纤维（4）上覆盖前部覆盖膜（7），吸水棉浆板（5）上覆盖后部覆盖膜（6），切割成长条，即得cTnI、NT‑proBNP和D‑dimer胸痛三联胶体金免疫试纸条体；（2）制备单克隆抗体：按体积计，分别取1份含有第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水、第二抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水、第一抗NT‑proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水、第二抗NT‑proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水、第一抗D‑dimer蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水和第二抗D‑dimer蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水，与2份60mM醋酸缓冲液混合，18～25℃搅拌下逐滴加入辛酸，每1mL小鼠腹水中加入30~35μL辛酸，混匀后，室温放置28~32分钟，13000~17000转/分、4℃离心18~22分钟，用玻璃棉过滤上清液，弃沉淀物，过滤后的上清液用NaOH调pH值至7.0~7.5，再加入硫酸铵，每1mL上清液中加入0.3‑0.4g硫酸铵，快速使硫酸铵溶解，18～25℃搅拌28~32分钟，13000~17000转/分、4℃离心18~22分钟、弃上清液，沉淀物用原小鼠腹水1/2体积的pH7.2的0.01M PBS溶液溶解，再放入pH7.2的0.01M PBS溶液中浸没，4℃透析45~50小时，用紫外分光光度计测定蛋白含量，即分别得胶体金标记用的第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体、包被检测线用的第二抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体、胶体金标记用的第一抗NT‑proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体、包被检测线用的第二抗NT‑proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体、胶体金标记用的第一抗D‑dimer蛋白质偶联物单克隆抗体、包被检测线用的第二抗D‑dimer蛋白质偶联物单克隆抗体；所述小鼠腹水是，将液体石蜡注射入6～8周龄BALB/C小鼠腹腔内，注射量为800～1000μL/只，2～3周后，将分泌第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体的杂交瘤细胞、分泌第二抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体的杂交瘤细胞、第一抗NT‑proBNP蛋白质偶联物单克隆抗1的杂交瘤细胞、第二抗NT‑proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体的杂交瘤细胞、第一抗D‑dimer蛋白质偶联物单克隆抗体的杂交瘤细胞、第二抗D‑dimer蛋白质偶联物单克隆抗体的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，注射杂交瘤细胞的数量为2×106个/只鼠，10～15天后用无菌注射器于小鼠腹腔采集腹水，即得第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水、第二抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水、第一抗NT‑proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水、第二抗NT‑proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水、第一抗D‑dimer蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水和第二抗D‑dimer蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水；（3）制备待标记的胶体金溶液：将800~1200mL蒸馏水，100℃煮沸3~7分钟，再加入质量浓度为1％的氯金酸溶液8~12mL和质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液13～20mL，搅拌至溶液呈深红色，冷却至18～25℃，K2CO3调pH值至待标记单克隆抗体的等电点或偏碱性，即为待标记的胶体金溶液；（4）制备胶体金标记物：取80~120mL步骤（2）制得的待标记的胶体金溶液3份，分别加入80~1200μg步骤（1）制得的胶体金标记用的第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体、胶体金标记用的第一抗NT‑proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体、胶体金标记用的第一抗D‑dimer蛋白质偶联物单克隆抗体，搅拌1~3分钟，再加入质量浓度为10％的BSA溶液终止反应，加入量为每mL溶液加入BSA溶液13~17μL，13000‑17000r/min离心45~55分钟，得沉淀物，沉淀物用pH 7.4、0.01M PBS溶液稀释至步骤（3）制得的待标记的胶体金溶液体积的20～40％，制得第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物、第一抗NT‑proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物、第一抗D‑dimer蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物；（5）制备固化胶体金标记物：用载体玻璃纤维分别吸取步骤（4）制得的第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物、第一抗NT‑proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物和第一抗D‑dimer蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物，干燥，制得第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体固化胶体金标记物、第一抗NT‑proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体固化胶体金标记物和第一抗D‑dimer蛋白质偶联物单克隆抗体固化胶体金标记物；（6）包被试纸条体：取步骤（2）制得的包被检测线用的第二抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体、包被检测线用的第二抗NT‑proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体、包被检测线用的第二抗D‑dimer蛋白质偶联物单克隆抗体，自左向右依次分别包被于硝酸纤维膜上，制备成第二抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体的检测线2‑1、第二抗NT‑proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体的检测线2‑2、第二抗D‑dimer蛋白质偶联物单克隆抗体的检测线2‑3，将抗鼠免疫球蛋白抗体包被于硝酸纤维膜上，制备成包被膜的质控线2‑4，即成胸痛三联胶体金免疫试纸条，所述的抗鼠免疫球蛋白抗体的包被浓度为0.4～6mg/mL，第二抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体、第二抗NT‑proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体、第二抗D‑dimer蛋白质偶联物单克隆抗体的包被浓度均为0.03～3mg/mL，即成。
所属类别：	发明专利