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原文传递驱动马达蛋白活性的检测方法

专利名称：	驱动马达蛋白活性的检测方法
摘要：	本申请公开了一种驱动马达蛋白活性的检测方法，包括以下步骤：(1)先将不同浓度三磷酸腺苷ATP分别和荧光素/荧光素酶混合，得到混合物；(2)将混合物分成两等份后分别加入测试样品池和对照样品池；(3)在对照样品池中再注入缓冲液，在测试样品池中注入驱动马达；(4)开启探测仪，检测测试样品池中的产物ADP与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光强度和对照样品池中的荧光强度，得到荧光强度时间曲线；(5)针对不同标准浓度的ATP，测得对应的F_ATP，进而生成校准曲线；(6)制作米氏曲线：(7)根据米氏公式，拟合所得的Vmax即是衡量驱动马达水解ATP的活性参数；(8)判断驱动马达活性。采用本发明的检测方法能够方便快捷的检测驱动马达蛋白活性。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	易尚明天科技有限公司
发明人：	舒咬根;罗永涛
专利状态：	有效
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201810348753.X
公开号：	CN108802401A
代理机构：	北京志霖恒远知识产权代理事务所(普通合伙) 11435
代理人：	郭栋梁
分类号：	G01N33/68(2006.01)I;G01N21/64(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N33;G01N21;G01N33/68;G01N21/64
申请人地址：	100000 北京市丰台区科学城星火路10号B-520室
主权项：	1.一种驱动马达蛋白活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)先将不同浓度三磷酸腺苷ATP分别和荧光素luciferin/荧光素酶luciferase混合，得到各浓度的混合物；(2)将各浓度的混合物分成体积相同的两等份，一份加入底部布满微管的测试样品池，另一份加入底部布满微管的对照样品池；(3)在对照样品池中再注入缓冲液，在测试样品池中注入驱动马达，则测试样品池发生酶促反应：其中，Kinesin·Microtubulen表示马达结合在微管的n位点；而Kinesin·Microtubulen+1表示马达结合在微管的n+1位点；k+表示Kinesin同时与ATP和微管的n位点的结合速率；k‑‑表示ATP从吸附在微管上的Kinesin解离的速率；kcat表示Kinesin对ATP的催化水解并向微管n+1位点步进的速率；(4)开启反应动力学定量探测仪，检测测试样品池中的底物三磷酸腺苷ATP与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光强度，旋转测试转盘后检测对照样品池中的荧光强度，在控制器的控制面板中分别显示测试样品池和对照样品池的荧光强度时间曲线；(5)针对不同标准浓度的ATP，测得每个浓度对应的ATP荧光强度FATP，进而生成校准曲线；(6)制作米氏曲线：根据所得到的校准曲线，按照以下公式拟合得到比例常数α7：在线性区间:[ATP]＝α7FATP，[ATP]表示ATP的浓度；FATP为与[ATP]对应的稳态时测试样品池的荧光强度减去对照样品池的荧光强度；VATP反应速率是所述荧光强度时间曲线在起始点的负导数：t为检测时间，fATP为[ATP]对应的实时荧光强度；不同浓度ATP存在对应的反应速率，以浓度为横坐标，反应速率为纵坐标，在坐标系中标出ATP浓度所述对应的VATP，连接这些点，制作得到米氏曲线；(7)求出Vmax：根据米氏公式：其中，Vmax表示最大水解速率；KM表示米氏常数；拟合所得的Vmax即是衡量驱动马达水解ATP的活性参数；(8)按照以下方法判断驱动马达活性：测试样品池中的转动马达数量：Nm＝NAv×10‑3×30×10‑6＝3NAv×10‑8；每秒能水解ATP的数量：NATP＝100×Nm＝3.0NAv×10‑6；对应的每秒mM数：VATPmax＝(NATP/NAv)×103/(100×10‑6)＝30mM/s；如果拟合的Vmax<1mM/s,则表明马达已经失活。
所属类别：	发明专利